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罗非鱼海豚链球菌病疫苗及其免疫效果研究
甘西1 陈明1
李莉萍1 余晓丽1
徐增辉2 李超2
雷爱莹1 陈汉忠2
梁万文1
(1广西水产研究所南宁530021；
2广西大学动物科学技术学院南宁530005)
摘 要
鉴于海豚链球菌已成为我国罗非鱼养殖发病死亡最主要的病原菌，本研究利用临床分离菌株对低剂量（1.5×10.5CFU?mL-1）攻毒耐过罗非鱼进行再次攻毒试验，筛选到1株具有很好交叉免疫保护的疫苗候选菌株CMS005，甲醛灭活制备成疫苗分别通过注射、浸泡及口服免疫罗非鱼。室内水族箱免疫试验中，注射、浸泡和口服三种免疫途径各自的最佳免疫保护率分别为90.5%、61.9%和14.3%；池塘小网箱免疫试验结果为100%、86.1%和66.7%。数据分析显示，相同剂量注射组免疫保护率明显高于浸泡免疫组与口服免疫组；免疫剂量对浸泡免疫和口服免疫效果的影响大于注射免疫；同时加强免疫可显著提高浸泡免疫与口服免疫效果；超声波处理也可提高浸泡免疫效果。生产小试结果表明，未免疫组罗非鱼月累计死亡率在6%～15%之间，而免疫组罗非鱼月累计死亡率不到0.5%；注射免疫和口服免疫效果相当，免疫7d和15d后均可完全控制罗非鱼海豚链球菌病的继续发生；疫苗发生的免疫保护力可持续2～3个月。上述结果表明，所研制的预防罗非鱼海豚链球菌病疫苗具有很好免疫效果及生产应用前景。
关键词 罗非鱼 海豚链球菌 疫苗
海豚链球菌（S.iniae）病是罗非鱼养殖业中危害最为严重的传染病［1，2，3］，海豚链球菌除感染罗非鱼和杂交罗非鱼，还感染多种海淡水养殖鱼类如日本鲆、鳗及虹鳟等［4，5，6］。此外，该菌还会随伤口感染人类［7，8］。美国、以色列及挪威等国在鱼类链球病疫苗研究方面做了大量工作并取得了较好的免疫效果，但也存在不少问题，如菌种间不存在交叉保护及菌株间免疫原性差异所造成的疫苗保护的地区差异，疫苗研究还处于实验室应用阶段等［9，10，11，12，13］。近年来，我国罗非鱼养殖暴发链球菌病呈上升趋势［3，14］，但还未见其疫苗相关研究报道。
本研究室经过2年在广西进行罗非鱼链球菌病流行病学及病原学研究，发现广西罗非鱼网箱养殖普遍发生链球菌病，累计死亡率在30%～60%之间，其造成的经济损失和随之带来的药物残留及环境污染已严重影响广西罗非鱼养殖业的健康发展［3］。同时对广西各地分离的罗非鱼链球菌株分类学研究发现，90%以上均为海豚链球菌病［3］。因此，利用本地流行菌株研制成可预防罗非鱼海豚链球菌病的疫苗显得非常必要。
1 材料和方法
1.1试验鱼与培养基
健康杂交罗非鱼（♀尼罗罗非鱼×♂奥利亚罗非鱼）由国家级广西南宁罗非鱼良种场提供，疫苗候选菌株筛选用罗非鱼大小在12～14g之间，半数致死量测定及免疫攻毒试验罗非鱼大小在75～100g之间。TSA培养基随机对其脑、肝脏和肾脏进行细菌分离为阴性。试验罗非鱼在大水族箱中饲养20d，直到连续7d未出现死亡方可用于试验。细菌培养用的TSB培养基成分均购于北京奥博星生物技术有限公司。
1.2菌株半数致死量测定
感染试验在45L水箱中进行，共6组，每组20尾。1～5组分别以1×105，1×106，1×107，1×108，1×109CFU?mL-1菌液（菌株CMS005）腹腔注射攻毒，每尾0.2ml；第6组为对照组，每尾注射等体积1.2%生理盐水。每2天换水2/3，水温在22℃～29℃范围，每天投饲率为试验鱼体重2%，分两次投喂。攻毒后观察20d，每天记录其进食、发病症状及死亡数，并用TSA平板对濒临死亡和死亡试验鱼进行细菌分离。
1.3疫苗候选菌株筛选
以广西3个不同水域发生的典型罗非鱼链球菌病分离到的3株海豚链球菌株CMS001、CMS005及CMS007为筛选对象，试验共设7组，每组100尾。Ⅰ～Ⅲ分别腹腔注射菌株CMS001、CMS005及CMS007，各菌液浓度为1.5×105CFU?mL-1，每尾0.2ml；Ⅳ～Ⅵ分别浸泡感染菌株CMS001、CMS005及CMS007，即将100尾试验罗非鱼浸泡于15L用自来水稀释成1.5×105CFU?mL-1各菌株悬液中，浸泡15min后转移至水族箱。Ⅶ为试验对照组；每尾腹腔注射0.2ml同体积生理盐水稀释的TSB培养液。每天观察各组的发病和死亡情况，直至所有试验组连续7d未出现死亡，次日用3菌株混合菌液（1.5×107CFU?mL-1）对所有试验组耐过罗非鱼进行腹腔注射感染，每尾0.2ml。每天观察各组的发病和死亡情况，记录直至所有试验组连续7d未出现死亡。
1.4疫苗制备
用TSB培养基将免疫原性和交叉保护力均较好的CMS005菌株28℃恒温培养56h。按本研究室研究出的工艺将其制备成注射型、浸泡型及口服型抗罗非鱼链球菌病疫苗。
1.5室内水族箱免疫保护试验
共7个试验组，每组30尾，免疫前驯养1周。Ⅰ～Ⅲ为腹腔注射免疫组，疫苗的细菌浓度依次为1.0×109CFU?mL-1、1.0×108CFU?mL-1和1.0×107CFU?mL-1，0.2ml/尾；Ⅳ为浸泡免疫组，在细菌浓度为1.0×109CFU?mL-1的浸泡型疫苗中浸泡30min后移至水族箱，两周后加强免疫一次；Ⅴ为口服免疫组，平均每尾的免疫剂量为0.2×109CFU；Ⅵ为对照组（不做任何处理）。每天按体重2%分两次投料，免疫3周后进行攻毒，每尾腹腔注射CMS005菌株（1.0×109CFU?mL-1）0.2ml，观察15d，记录各组死亡和发病情况。
1.6池塘小网箱免疫保护试验
试验共设11组，每组30尾，免疫前驯养1周。Ⅰ～Ⅲ为腹腔注射免疫组，疫苗的细菌浓度依次为1.0×10
9CFU?mL-1、1.0×108CFU?mL-1和1.0×107CFU?mL-1，0.2ml/尾。Ⅳ～Ⅶ为浸泡免疫组，其中Ⅳ～Ⅵ组疫苗的菌液浓度依次为1.0×109CFU?mL-1、1.0×108CFU?mL-1和1.0×107CFU?mL-1，浸泡30min，两周后加强免疫1次。Ⅶ组浸泡浓度为1.0×108CFU?mL-1，浸泡时超声波15min，两周后加强免疫1次。Ⅷ组浸泡浓度为1.0×108CFU?mL-1，不进行加强免疫。Ⅸ～Ⅺ为口服免疫组，其中Ⅸ和Ⅹ组的免疫剂量分别为0.2×109和0.2×108CFU/尾，两周后加强免疫1次；Ⅺ免疫剂量为0.2×108CFU/尾，不进行加强免疫；Ⅻ为对照组，不做任务处理。每天按体重2%分两次投料，3周后攻毒，每尾腹腔注射CMS005菌株（1.0×107CFU?mL-10.2ml）观察15d，记录各组死亡和发病情况。
1.7生产小试免疫试验
在南宁市邕江不同区段选择6个罗非鱼网箱养殖户为试验点，所有试验点均进行了注射免疫，其中2个试验点还进行了口服免疫，接种剂量均为0.2×109CFU/尾。6个试验点在免疫接种时均不同程度的发生海豚链球菌病，月累计死亡率在6%～15%，接种前均使用抗生素进行过治疗，但无效。
1.8统计学处理
所测数据用Excel统计软件处理，各组间差异用t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2结果
2.1CMS005菌株半数致死量测定
人工回归感染实验结果见图1，高浓度感染组（1×109，1×108和1×107CFU?mL-1）试验罗非鱼的死亡均发生在注射后的前两天，第6天停止死亡；低浓度感染组（1×106和1×105CFU?mL-1）罗非鱼的死亡率分别为50%和15%。因此，CMS005菌株对试验罗非鱼的半数致死量为0.2×106CFU。
图1 分离菌CMS005进行的腹腔注射感染实验结果
a，b，c，d，e分别表示菌浓度为1×109，1×108，1×107，1×106和1×105CFU?mL-1感染组，control为对照组
2.2疫苗候选菌株筛选
3株细菌均通过低剂量腹腔注射和浸泡两种途径对健康罗非鱼感染，感染后的1～15d均不同程度地出现死亡，第15d后停止。停止死亡10d后，各试验组选20尾耐过罗非鱼以CMS001、CMS005及CMS007混合菌液进行第2次感染，各试验组2次死亡统计结果见表1。
表1 三株海豚链球菌两次不同剂量感染试验
感染菌株第1次感染攻毒途径/剂量第1次感染死亡率（死亡数/总数）第2次感染※死亡率（死亡数/总数）
CMS001注射 /0.3×105（CFU/尾） 5.12 （4/78） 45 （9/20）
CMS005注射 /0.3×105（CFU/尾） 39.24 （31/79） 0 （0/20）
CMS007注射 /0.3×105 （CFU/尾） 17.1 （13/76） 10 （2/20）
CMS001浸泡 /1.5×105 CFU?mL-1 2.22 （2/90） 75 （15/20）
CMS005浸泡 /1.5×105 CFU?mL-1 7.78 （7/90） 35 （7/20）
CMS007浸泡 /1.5×105 CFU?mL-1 5.56 （5/90） 60 （12/20）
注射对照注射/等量TSB 1 35 （1/74） 85 （17/20）
浸泡对照不做任何处理 0 （0/85） 80 （16/20）
※注：第1次感染停止死亡10d后，各试验组选20尾耐过罗非鱼以菌株CMS001、CMS005及CMS007混合菌液通过腹腔注射进行第2次感染，感染剂量为0.3×107CFU/尾。
2.3室内免疫保护试验
疫苗的免疫效果通过统计攻毒后各免疫组相对对照组的成活率和保护率来显示，攻毒剂量为0.2×109CFU/尾。腹腔注射的3组及浸泡免疫组的成活率及保护率均明显高于对照组，差异极显著（P＜0.01），各组数据统计如表2。
表2 室内免疫保护试验结果
免疫途径（次数 ）接种剂量 存活数/总数 存活率（%） 免疫保护率（%）
腹腔注射（1次） 0.2×10 9 22/24 91.67 90.5
腹腔注射（1次） 0.2×108 21/24 87.5 85.8
腹腔注射（1次） 0.2×107 17/24 70.83 76.7
浸泡（2次） 0.2×109 16/24 66.67 61.9
口服（2次） 0.2×109 6/24 25.0 14.3
对照组 等量PBS 3/24 12.5 -
2.4池塘小网箱免疫保护试验
由于室内免疫保护试验口服免疫组攻毒后罗非鱼死亡时间相对对照组明显推迟，但其存活率与对照组相差不大，这很可能是因为攻毒剂量过大，疫苗刺激罗非鱼产生的免疫保护力不足以抵抗0.2×109CFU细菌感染。因此，本次免疫保护试验的攻毒剂量改为0.2×107CFU/尾，各组数据统计如表3。
表3
小网箱免疫保护试验结果
免疫途径（次数） 剂量（CFU/尾） 存活数/总数 存活率（%） 免疫保护率（%）
腹腔注射（1次） 0.2×109
23/23 100
100
腹腔注射（1次） 0.2×108
14/14 100
100
腹腔注射（1次） 0.2×107
14/15 93.33
91.7
浸泡（2次） 0.2×109
16/18 88.89
86.1
浸泡（2次） 0.2×108
12/15 80
75.0
浸泡（2次） 0.2×107 12/17 70.59 63.2
浸泡（2次，超声波）0.2×108 18/22 81.82 77.2
浸泡（1次） 0.2×108 21/35 60 50.0
口服（2次） 0.2×109 16/25 64 55.0
口服（2次） 0.2×108 22/30 73.33 66.7
口服（1次） 0.2×108 6/13 46.15 32.7
对照组 等量PBS 6/30 20 -
2.5生产免疫保护试验结果
免疫后通过60d的观察与统计，疫苗在各试验点均产生了很好的免疫保护力，有效控制了海豚链球菌病发生。疫菌产生的免疫保护期至少为2个月，免疫后累计死亡数据见表4（注射组从接种后第10d开始计算，口服组从2免后第3d开始计算）。
表4
生产免疫保护试验结果
统计项目
试 验 点
1
2 3 4
5 6
月累计死亡数/网箱（注射免疫组） 12 2
16 9 10
2
月累计死亡数/网箱（口服免疫组） 8 -※ -※ -※ -※
13
月累计死亡数/网箱（对照组） 126 183
312 156 216 256
※注：未进行口服免疫试验
3讨论
近年，罗非鱼海豚链球菌病已严重影响广西罗非鱼网箱养殖，从鱼苗到成鱼持续发病死亡，绝大部分网箱罗非鱼养殖的收成率不到50%，造成巨额经济损失。同时，部分研究认为感染的罗非鱼是人类感染海豚链球病的传染源，并推测其感染途径可能是人接触病鱼时因刺伤而被感染［16］。而目前找不到方法有效控制该病，并且还因大量抗生素等药物滥用而造成菌株变异、水体微生态破坏及水质进一步恶化，给该病的防治带来了更大困难。国外拟通过疫苗研发最终控制该病，但目前这一工作还只限于实验室，未见商品化罗非鱼链球菌病疫苗出现［9，10，11，12，13］。不过实验室研究表明，灭活海豚链球菌疫苗可刺激罗非鱼产生较强的免疫力，可抵抗高浓度海豚链球菌的人工感染［17］。
相对国外报道的鱼类链球菌病疫苗研究，本研究室在疫苗候选菌株筛选、疫菌制备及免疫程序方面等都进行了一些改进和探索。首先是摸索出疫苗候选菌株筛选的方法，研究利用低剂量攻毒耐过罗非鱼再次攻毒方法对3株具有代表性的临床菌株进行免疫原性比较与筛选，发现菌株CMS005致病性比CMS001和CMS007强，同时具有很好免疫原性和交叉保护能力，耐过鱼可同时抵抗3株细菌的感染，因此选定CMS005为疫苗候选菌株。这一试验说明不同链球菌株在毒力及免疫原性是有区别的，能否筛选到免疫原性好、具有交叉免疫保护的菌株对疫苗研发非常关键。其次是疫苗制备方面，研究通过对甲醛浓度进行了梯度试验，找到了灭活海豚链球菌的最佳方法，又通过超滤浓缩去除甲醛，最大限度降低了甲醛对鱼的毒性及应激作用。通过超滤孔径大小控制，去除了一些对疫苗免疫效果有影响的成份，从而进一步提高了疫苗的免疫保护作用。另外，疫苗的应用更加方便，目前绝大多数鱼类疫苗只有通过注射免疫才能起到免疫保护作用，使用起来不仅费时、费力，并且对鱼的应激也大。本研究的口服疫苗在实验室及生产免疫保护性试验中均表现出极好的免疫效果，这对以后疫苗的推广应用奠定了坚实的基础。
室内水族箱免疫保护试验中，口服免疫组的保护率虽然只有14.3%，但攻毒后，免疫组罗非鱼死亡集中在攻毒后48～72h，对照组罗非鱼死亡集中在攻毒后的前18h，这种死亡的推迟表明了口服免疫罗非鱼明显产生了免疫保护力，只是产生的免疫力不足以抵抗0.2×109CFU高剂量链球菌感染。这种推断在后面的池塘小网箱免疫保护试验及生产试验中进一步得到了证明，由于池塘小网箱免疫保护试验中的攻毒剂量为0.2×107CFU，而生产中水体病原菌的浓度更是低于这一剂量，其免疫保护率得到了大幅度提高，尤其是生产小试中，口服免疫组与注射免疫组的保护率相当。比较不同免疫剂量的免疫效果，发现免疫剂量对注射免疫和口服免疫效果影响不是很明显，但对浸泡免疫的影响较大，这很可能是因为浸泡免疫作用时间短，免疫原仅仅通过30min对体表及消化道粘膜的免疫组织作用，因此免疫原的浓度与免疫效果成正相关。同时，超声波可明显提高浸泡免疫效果，这与周永灿［15］报道结果一致，其原因可能是浸泡免疫时超声波能有效增加生物机体和肌肉等组织通透性，从而增加的抗原摄取量。另外，15d后加强免疫1次可明显提高口服免疫和浸泡免疫效果，其机理在各免疫组罗非鱼的体液免疫指标、细胞免疫指标及非特异免疫指标上得到了体现［18］。
综上所述，该研究为预防和控制我国罗非鱼链球菌病，提高水产品质量，减轻因抗菌素滥用给人类健康和生态环境带来的严重危害提供了一种可行的方法，研制的疫苗具有很好的经济、社会和生态意义。
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