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分子标记技术在凡纳滨对虾中的应用进展
杨彦豪 陈晓汉
谢达祥
(广西水产研究所 南宁
530021)
摘要
随着生物技术的迅猛发展，分子标记的应用越来越受到生物学家和育种家的重视。本文对DNA分子标记的种类及其特点进行了概述，并论述了目前DNA分子标记在凡纳滨对虾中的应用进展，同时对其应用前景进行了分析。
关键词
分子标记技术 凡纳滨对虾
应用
遗传和变异是生物的重要特征，它决定着生物的存在和发展，因而，人们一直为揭开其奥秘并进行能动性创造而努力。近十几年以来，随着分子生物学理论和实验技术的发展，分子标记等技术取得了长足的发展，为培育新品种提供了有效的手段。DNA分子标记是20世纪70年代以来迅速发展起来的一种遗传标记，主要是指生物基因组DNA经限制性内切酶酶切、聚合酶链式反应(PCR)扩增或两者结合等措施处理后电泳，检测到的反映基因组某种变异特征的特异性DNA片断。它可以从分子水平上直接测定出遗传物质DNA的变异性，与其它标记相比，分子标记具有无表型效应、不受环境限制和影响、多态性高、标记数量多、对生物体没有不良影响等优点，其结论可靠、效率高，从而为它的广泛应用奠定了基础。
凡纳滨对虾(Litopenaeus
vannamei)，又称为南美白对虾，太平洋白对虾，自然分布于秘鲁至墨西哥太平洋沿岸，在对虾渔业及养殖工业中占有重要地位，是西半球最重要的养殖品种［1］，目前在中国、泰国、巴西等国家也已具相当规模。由于疾病流行，环境恶化及对对虾生理、遗传特征缺乏了解，对虾养殖业的健康发展面临着严重的挑战。利用DNA分子标记技术促进凡纳滨对虾遗传改良，将是对虾养殖业可持续发展的有效途径。
1目前常用的分子标记技术
1.1限制性片段多态性(Restriction Fragment
Length Polymorphism，RFLP)
RFLP是最早发展的分子标记，至今仍被广泛的应用。其技术要点是：DNA经限制性内切酶酶切后，产生若干不同长度的小片段，由于不同来源的DNA具有不同的限制性酶切位点，每一种DNA/限制性酶组合所产生的片段是特异的，从而产生多态性；这些不同的片段经琼脂糖凝胶电泳分离，印迹转移(southern
transfer)至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；然后用一放射性同位素(32P)标记的特定DNA克隆(clone)探针(probe)杂交；放射自显影后，杂交带便能清晰地在X光胶片上显示出来。若样品间DNA有差异，则可产生不同长度的酶切片段，显示出不同的杂交带型，这种差异就是RFLP。RFLP的主要优点表现在较高的可靠性，由限制性内切酶切割特定位点产生；多样性，通过酶切反应来反映DNA水平上所有差异；共显性，能区别杂合体与纯合体；数量性和来源于自然变异等。但是RFLP也有其固有的缺陷：首先是对DNA的量要求大、操作繁琐，相对费时；其次是具有种属特异性，且只适应单／低拷贝基因，限制了其实际应用；再次
RFLP多态信息含量低，仅0.2左右［2］；最后，RFLP需要制备放射性探针，对人体健康有影响，对环境也有污染。
1.2随机扩增多态性DNA(Random Amplified
Polymorphic．RAPD)
RAPD技术是由Williams等首先创立的一种DNA分子标记技术，利用的10个碱基的寡核苷酸序列作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列多态性。RAPD技术与RFLP技术有许多相似之处，都是以DNA序列在不同物种中的差别为出发点，以产生大小、数量不等的DNA片段为目的，而所用的手段和方法却截然不同，RAPD是通过DNA聚合物连续反应(PCR)的原理，随机合成若干多态DNA分子片段，而RFLP是通过限制性酶切技术，从中找到多态性DNA分子片段。与RFLP相比，RAPD技术简单，容易掌握，在短期内即可获得大量的分子标记，它既克服了同工酶位点偏少的缺点，又避免了RFLP操作技术复杂的弊端，而且RAPD技术的成本要比RFLP技术低。RAPD的缺点是绝大部分RAPD标记是显性标记，不能区分基因型是纯合或是杂合的；试验结果可靠性和重复性低；分辨率低；无法分析差异原因。
1.3序列特异性扩增区(Seguence Characterized
Amplified Region，SCAR)
为了克服RAPD技术稳定性低的缺点，1993年Puran和Michelmore在RAPD基础上提出了SCAR标记，即对特异RAPD片段进行测序，然后根据两端序列设计1对18～24碱基的引物(在原来RAPD引物上增加8～14个碱基)，在较高的退火温度下进行特异扩增，这使得SCAR在稳定性和重复性上都比RAPD增强了很多［3］。
1.4线粒体DNA标记(mtDNA)
线粒体DNA(mtDNA)是高等动物唯一的核外遗传物质，是一种约165KB的双链螺旋环状分子。其基因结构、遗传密码和复制具有一些不同于核基因组的特点。遗传方式为母性遗传，比核DNA具有更高的进化速度，采用θ型或滚环型半保留复制，也有特殊的D环(D-loop)复制。由于碱基取代、长度变化和序列重排等造成了mtDNA的多态性。故可用限制性酶切技术直接探查mtDNA的多态性。通过对mtDNA多态性的分析，可以了解群体的遗传结构、基因流动及系统发育等方面的情况。近年来对人类mtDNA与疾病关系的研究发现，许多不遵守孟德尔遗传规律，证明呈母性遗传的疾病同mtDNA突变有关。
1.5扩增片段长度多态性(Amplified Fragment
Length Polymorphism，AFLP)
AFLP是Zabeau等发明的一项技术，它结合了RAPD和RFLP的特点，既具有PCR的高效性、安全性和方便性的特点，又具有RFLP可靠性、重复性高的优点，不需要了解基因组信息，且只需要少量纯化的基因组DNA即可对整个基因组DNA酶切片段进行选择性扩增，适合于所有基因组的检测。AFLP的基本原理是对基因组总DNA酶切后经PCR进行选择性扩增，随后将特定的接头连接在这些DNA片段两端。接头序列和邻近的限制性酶切位点序列作为引物结合位点，然后用特定引物进行PCR扩增，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的特异限制片段。AFLP的不足之处在于它不是共显性标记，扩增片段少数是共显性条带，多数是扩增片段有／无显性条带，条带统计分析难度较大；标记引物需要同位素或其他化学试剂，相对费时，且对操作人员的试验技术水平要求较高：对模板DNA的质量要求较高，且需模板DNA量多于2μg。
1.6简单序列重复(Simple Sequence
Repeat，SSR)
SSR又称为微卫星(Microsatellite)，短串联重复(Short
Tandem Repeat，STR）或简单序列长度多态(Simpie Sequence Length
Polymorphism，SSLP)，是
2007年来迅速发展起来的一种分子标记，是1～6个碱基串联重复序列，在至今研究的所有生物基因组中均有分布。其原理是利用SSR为引物进行PCR扩增，扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后进行多态性分析。微卫星由于分布随机广泛(包括编码区和非编码区)，多态性高，符合孟德尔遗传模式呈共显性遗传，可区分纯合子和杂合子，且适于自动化操作等特点，成为物种的基因型鉴定与品种保护、种子纯度评价和种质保存、多样性研究、基因和QTL分析、谱系分析和分子标记辅助选择育种、资源鉴定、连续图谱绘制和克隆并筛选大片段文库等领域的有用工具，是应用较为广泛的遗传标记。SSR的缺点是必须针对每个染色体座位的SSR，测定并找到其两端的单拷贝序列设计引物。
1.7表达序列标签(Expressed Sequence
Tags，EST)
EST主要是在cDNA文库中随机挑选克隆，并进行单向测序而产生的250～400bp的核苷酸序列片段。与一般的遗传标记相比，它的优越性主要表现在它是直接与一个表达基因相关，并且容易转变成STS(Simple
Tag
Sequence)，同时大量的EST可以积累建立一个新的数据库，为表达基因的鉴别等研究提供大量信息。目前EST标记已经广泛的应用到植物上，为表达基因的物理定位，构建基因转录图谱及高密度遗传连锁图谱奠定了基础［4］。但是EST费用高，DNA质量要求严格。
1.8单核苷酸多态性(Single nucleotide
polymorphism，SNP)
SNP是近年来出现的第三代遗传标记，它广泛地分布于染色体上。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。SNP作为一类遗传标记主要有以下几个优点：位点丰富，SNP几乎分布于整个基因组，据估计，基因组中大约平均每1000bp就会出现一个SNP，这样它们在整个基因组的分布就达到300万个；具有代表性，某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素；遗传稳定性，与微卫星等重复序列多态性标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性；容易实现分析的自动化。
2目前分子标记技术在凡纳滨对虾中的应用
2.1凡纳滨对虾群体遗传多样性
凡纳滨对虾基因组杂合度高，存在着大量的多态性，并且国内的凡纳滨对虾大部分都是从国外引进的，所以用以往所采用的形态解剖、生理生化等方法很难对对虾品种鉴定、亲缘关系和进化变异等进行准确的研究和分析，因而限制了凡纳滨对虾种质资源的获得、保持、保护和充分利用，延缓了凡纳滨对虾的育种效率。DNA分子标记技术使凡纳滨对虾种质资源研究中的一些难题迎刃而解，并且DNA分子标记在鉴定品种真实性和纯度等方面也是很有效的，DNA指纹图谱能从遗传物质基础上，即从本质上反映生物个体差异的DNA电泳图谱，它具有高度个体特异性和稳定可靠性。通过对DNA指纹的比较及借助相关计算机软件的聚类分析［5～7］，可以对对虾种、亚种、变种、品种和品系的进化与演化，亲缘关系进行分析。2004年VallesJimenez
R等用5个微卫星分子标记对墨西哥和帕纳马的凡纳滨对虾的群体遗传结构进行了分析，通过每个位点的平均等位基因数和平均观测杂合度来估计两个群体之间的遗传差异，结果表明在每个位点中大部分座位都严重的偏离了哈德-温伯格平衡，提示人们要利用和保护对虾资源的遗传多样性［8］。李锋等利用PCRRFLP技术分析了凡纳滨对虾两个引进亲本群体的遗传多样性，发现有两个引物在两个亲本群体间存在明显的差异［9］。Garcia
DK等利用RFLP、RAPD和同工酶三种分子标记技术对凡纳滨对虾两个SPF群体和一个SPF候选群体的遗传多样性进行了分析，通过比较发现，同工酶的多态性较低，认为DNA分子标记在个体育种中检测遗传多态性的效率更高，有利于基因型和期望得生长速度和繁殖力相关联［10］。Ana
Karina de Francisco等利用mtDNA技术对5个凡纳滨对虾同胞群体的遗传关系进行了分析，通过对COI源序列的分析发现5个群体之间的遗传距离为0.2～1.0％，认为这些遗传变化与遗传漂变或群体建立时的初始效应相关［11］。
2.2凡纳滨对虾遗传连锁图谱的构建
遗传连锁图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图。经典的遗传图谱是根据形态、生理和生化标记构建的，由于这些遗传标记的数量在作图群体的两亲本上极为有限，所以发展很缓慢，并且这些图谱的分辨率和饱和度都不高，应用价值有限。DNA分子标记用于遗传图谱的构建是遗传学领域重大进展之一，分子遗传图谱的构建是根据某一多态性DNA片段在分离群体中分离情况的直接观察统计而实现的。分子遗传图谱比传统遗传图谱位点多，构建速度快，效率高，且不受发育阶段及环境条件的影响，发展相当迅速，随着新的DNA标记技术的发展，标记种类越来越多，密度越来越高。遗传图谱的构建是遗传学研究的重要领域，也是遗产学研究的有力工具。完整的连锁图谱对于深入开展各种分子生物学研究是非常必要的，如标记辅助选择（MAS）、质量性状基因定位（QTL）图谱定位功能基因、杂交优势预测、基因组进化等，因此遗传图谱的构建和对基因组进行系统性研究，是动植物遗传育种和人类遗传疾病诊断和治疗的依据。
凡纳滨对虾的遗传图谱构建工作相对落后，Moore等利用246个多态性AFLP标记构建了日本对虾AFLP图谱，其中129个标记分布于44个连锁群，预计覆盖整个基因组的57％左右［12］。Wilson等利用23对AFLP引物筛选得到673个遵循孟德尔遗传的斑节对虾多态性AFLP标记，其中116个共有AFLP标记分布于20个连锁群，图距为1412cM［13］。岳志芹等利用AFLP分子标记结合“拟测交”策略，以中国对虾的单对杂交亲本及其F1代为作图群体，应用MAPMAKER
EXP／3.0软件，分别构建了中国对虾雌、雄的遗传连锁图谱，所构建的连锁图谱分别覆盖了基因组长度的47.5％和35.6％［14］。Franklin等应用103个AFLP标记对42个杂交子代个体建立了与凡纳滨对虾性别相关的遗传连锁图谱，通过对基因组长度估计表明凡纳滨对虾的基因组重组率高于其它对虾［15］。Zhang
L等利用108个AFLP标记组合和30个SSR标记构建了凡纳滨对虾的遗传连锁图谱，其中319个标记分布于雌性遗传图谱的45个连锁群中，覆盖的图距为4134.4cM；267个标记分布于雄性遗传图谱的45个连锁群中，覆盖的图距为3220.9cM，同时还发现了3个与性别相关的SSR标记，为凡纳滨对虾高精度遗传图谱的构建、QTL定位和比较基因组作图奠定了基础［16］。
2.3凡纳滨对虾亲子遗传关系研究
应用各种遗传方法改造生物的遗传结构，培育优良品种是当前水产动物学研究的热点之一，但是仅从形态学、细胞学等方面有时很难区分亲子代的遗传变异等关系，而DNA分子标记在此有着广阔的应用空间。李锋等利用PCRRFLP技术分析了凡纳滨对虾两个引进亲本群体及其各自子一代的遗传多样性，了解在全人工的养殖条件下凡纳滨对虾的遗传变异情况，从分子生物学角度为养殖凡纳滨对虾的亲虾引进和育苗提供了理论依据［17］。张留所等利用10个微卫星位点鉴定了两个选育家系的亲子关系，通过遗传模式研究，首次在凡纳滨对虾中发现了较大比例的无效等位基因，为其用于连锁图谱构建，种群遗传分析提供了一定依据［18］。
2.4家系鉴定
对虾等甲壳类动物在生长过程中需要多次蜕皮，因此在鱼类、贝类上常用的体外标记方法并不适应于对虾。近年来，体内植入标记的方法已经开始在对虾上应用［19，20］，但这种方法无法实现早期标记，因为处于仔虾期的个体较小，一般体长只有2mm左右，这就给体内植入标记增加了难度，并且标记过的个体往往失去商品价值，不适合在与商业化相结合的育种计划中使用。DNA分子标记技术的兴起，克服了以往物理标记的缺陷，实现了不同对虾家系在早期进行标记混养，从而保证了它们处于相同的生长环境中，减少了因外界环境因素引起的表型值误差。王鸿霞等以凡纳滨对虾选择育种项目中建立的家系为实验材料，评估了6个微卫星标记区分和鉴定凡纳滨对虾家系的能力，探讨了家系混养情况下利用微卫星标记辅助构建凡纳滨对虾家系，实现大规模商业化育种计划的可能性［21］。
2.5凡纳滨对虾病毒检测
随着我国对虾养殖新品种的引进，凡纳滨对虾以其盐度适应范围广、生长速度快、抗病力强等优点而成为国内主要对虾养殖品种，苗种及亲虾的大量引进增加了疾病传入我国的机会，在我国已经出现几种病毒，并且也造成了一定的经济损失。目前对虾病毒病的诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫学方法、分子杂交方法及PCR方法等。其中PCR方法是这些方法中特异性最强、敏感性最高的病原检测手段，在国外已经被广泛应用于对虾病毒病的检测和诊断。多重PCR是一种特殊的PCR形式，其最突出特点是一次PCR反应可以同时检测、鉴别出多种病原体，在临床多种病原混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值。谢芝勋等建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的二温式多重PCR技术［22］。黄新新等利用RTPCR检测对凡纳滨对虾桃拉综合征病毒进行了检测［23］。杨冰等建立了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)PCR检测方法［24］。陈晓汉等利用一步二温式RTPCR法检测南美白对虾的桃拉综合症病毒［25］。谢芝勋等建立了二温式多重PCR同时检测鉴别WSSV和TSV的方法，并将该种方法应用到广西沿海对虾养殖业的检测中［26］。
3前景展望
3.1分子标记辅助育种
遗传学家提出利用遗传标记和遗传图谱进行辅助选择来加快生物遗传改良进程的理论。标记辅助选择(MAS)是指通过对遗传标记的选择，间接实现对控制某性状的QTL(数量性状基因位点)选择，从而达到对该性状的选择目的。标记辅助选择有效的前提是标记与目标性状紧密连锁，从理论上讲，当标记所示的加和性变异的分数超过狭义遗传力时标记辅助选择则优于传统的遗传选育法。与常规遗传标记相比，DNA分子标记信息量大、扫描遗传位点多且用之选择不受其他基因效应、内外环境因素以及基因表达与否等因素的影响，分析结果准确可靠，可在早期进行选择，从而大大缩短育种周期，必将成为对虾育种工作的有效工具。一般认为应用传统选育技术，每代的遗传获得率通常在10％～15％，而用分子标记选择育种技术可明显提高选育进度，特别是那些靠传统的表型工具难以度量的性状。MAS在凡纳滨对虾育种中可以应用于杂交亲本的选配、杂种后代的早期鉴定选择、染色体片断去向追踪、遗传转化中目的基因的检测、多种抗病性状筛选等方面。
3.2数量性状基因位点(Quantitative Trait
Locis，QTL)定位
QTL定位是标记辅助选择应用的前提。QTL定位就是确定QTL在基因图谱中的位置以及与之紧密连锁的标记，对其实现操作利用，是根据已经建立的具有一定饱和度、精度的基因图谱，利用分子标记与QTL间的连锁不平衡现象，采取适当的统计方法和定位方法，来估测连锁的紧密程度和遗传距离，将QTL定位于基因图谱的具体位置上，并得出单个QTL的效应值。检测和定位QTL的方法主要有基因组扫描法和候选基因法。基因组扫描法又称为分子标记-QTL连锁分析法，利用分子标记在参考分离家系中来对与数量性状相连锁的基因组区域进行扫描，通过分析这些分子标记在参考家系中的分离，即标记基因型与QTL表型变异之间的连锁关系来检测QTL的存在，并确定QTL连锁群以及在图谱上的位置，估计QTL效应值。候选基因法是依据生理生化知识对QTL进行剖析，选择与QTL有关的主基因座位作为候选基因，分析这些候选基因的性状差异与DNA变异之间的关系，以及这些候选基因的变异与目标性状表型变异之间的关系，推断哪些候选基因可能参与了目标性状的形成与目标性状有关，寻找与目标性状表型差异相关的DNA信息作为标记分析其遗传效应，筛选出对QTL有影响的标记，并估计出效应值。开展凡纳滨对虾重要经济性状(包括与抗病、抗逆、耐盐等有关的数量性状)定位，寻找与重要经济性状相关的分子标记，是今后凡纳滨对虾研究的重点之一。
3.3基因定位克隆
传统克隆基因的方法是根据已知基因的产物推算其相应的核苷酸序列，再根据此序列合成探针，从cDNA文库或基因组文库中钓取目的基因。遗传标记最主要的应用之一是克隆基因，利用分子标记及NIL、BSA和比较基因组作图等新技术，对目的基因进行精细定位，获得与目的基因紧密连锁的分子标记后，再以它为探针筛选大片段基因文库，并构建目的基因区域的物理图谱，通过染色体步查(chromosome
walking)逐步逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome
landing)找到包含该目的基因的克隆，再通过遗传转化证实目的基因的功能，通过对这些基因的结构和序列研究，进行基因重组和改造，从而可以应用于其它不具备此性状的水产动物的遗传改良研究中。目前在凡纳滨对虾上这方面的研究起步较晚，但随着凡纳滨对虾分子遗传图谱、基因标记研究的深入，凡纳滨对虾重要基因的定位克隆必将会有重大突破。
3.4比较基因组作图
比较基因组研究主要是利用相同的DNA分子标记在相关物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或其片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并据此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。比较基因组研究使得传统遗传学突破了物种的框架，发展成为新的系统遗传学，除了在对物种进化研究上有重要意义外，还推动了整个生物遗传学的研究，使人们对模式生物基因组研究的结果能应用到其他相关物种中。
综上所述，分子标记技术在凡纳滨对虾研究中具有重要的应用价值，并且已经取得了一定的进展，展现了广阔的应用前景，但是，目前分子标记技术在凡纳滨对虾中的应用还处于初级阶段，还需要进行更深入的研究，相信随着分子标记技术的不断发展和完善，必将推动凡纳滨对虾研究进入一个新的阶段。
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