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斑点叉尾鮰肠败血症病原菌的分离与鉴定
梁万文1 陈明 1 余晓丽 1 李莉萍 1 雷爱莹 1 陈汉忠2 徐增辉 2 甘西 1 黄维义2 (1广西水产研究所南宁530021；2广西大学动物科学技术学院南宁530005)
摘要近两年来，一种严重的传染性疾病在广西斑点叉尾鮰养殖业中流行，造成鱼苗100%死亡；成鱼的损失也高达30%～80%不等。为了确定该病病原，本试验对患病斑点叉尾鮰脑、肝脏、脾脏和肾脏组织进行了细菌的分离、鉴定及致病性试验。结果从南宁和合浦两地分离到NN和HP两株G短杆菌，人工感染试验表明，腹腔注射感染可引起健康斑点叉尾鮰100%死亡，浸泡感染可引起30%～55%死亡，并且感染发病的斑点叉尾鮰症状与自然发病症状相似。两株细菌的形态特征、培养特性和生理生化反应指标均与国外报道的鮰爱德华氏菌参考菌株（JCM1680）相同；两株细菌的16S rRNA基因序列与JCM1680菌株16s rRNA基因序列同源性均为993%。以上研究证实，NN和HP两株细菌为致病性鮰爱德华氏菌，其引起的传染性疾病为斑点叉尾鮰肠败血症。本研究首次对国内斑点叉尾鮰肠败血症进行病原菌的分离和鉴定，证实了斑点叉尾鮰肠败血症在广西斑点叉尾鮰养殖业中的流行及造成严重经济损失，对国内该病的控制及斑点叉尾鮰健康养殖具有重要的指导意义。
关键词斑点叉尾鮰 肠败血症
爱德华氏细菌 鉴定 鮰爱德华氏菌所引起的斑点叉尾鮰肠道败血症（Enteric Septicaemia of Catfish ESC），是于1976年在美国亚拉巴马州和佐治亚洲的河鮰鱼（也称鲇鱼）中首次发现，继之ESC成了美国南部鮰鱼养殖业危害最大的传染病 ［1-3］，世界卫生组织已将ESC列为重要的鱼病，同时将该病列为进出口法定检测项目［4］。 近年来，随着水体环境的恶化和养殖密度的增加，造成斑点叉尾鮰养殖病害的泛滥，伴随而来的药物滥用，导致药物残留，养殖生态环境恶化，鱼产品质量下降，出口受阻，已严重影响我国斑点叉尾鮰养殖业可持续健康发展。近年广西斑点叉尾鮰养殖中一传染病发生频率最高，造成的经济损失最大。该病的主要特征有：从鱼苗到成鱼均可大面积暴发；流行时间跨度大，3月到12月均可发生该病。为确定该病病原，本实验室开展了以下研究。
1材料与方法 1.1实验鱼 1.1.1 患病斑点叉尾鮰 2006年4～7月，取自广西南宁和合浦两地网箱养殖发病斑点叉尾鮰南宁为20～50g小鱼；合浦为刚投放鱼苗，2～5g），发病率分别为30%和90%左右，主要症状均为鱼嘴周边及各鳍充血、出血发红，腹胀，部分病鱼头顶出现裂缝，浮于水面时游姿平衡失调，时而单方向转圈游动。 1.1.2 健康斑点叉尾鮰 广西水产研究所淡水养殖基地赠送，体重10～15g，饲养在150L的塑料水箱中，每天投喂2次。饲养所用的水为曝气24h的自来水，两天换水1次，水温控制在25℃左右。 1.1.3 实验试剂及配制 牛脑浸粉和牛心浸粉为北京奥博星生物技术有限公司产品；胰蛋白胨、琼脂、葡萄糖和氯化钠购于上海生工生物工程技术服务有限公司；Tap聚合酶、dNTP和DNA抽提试剂盒为TIANGEN产品。牛脑心培养基（BHIA）配方：牛脑浸粉10.0g，牛心浸粉10.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖2.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，加蒸馏水至1000ml，pH值调至6.8-7.2范围，高压灭菌15min，BHI为不加琼脂的液体培养基。 1.2 细菌的分离与纯化 无菌条件下，从患病斑点叉尾鮰脑、肝脏、脾脏和肾脏组织等部位取样，在BHIA平板上划线分离，28℃恒温培养48h，挑取优势菌的单菌落在BHIA平板上再次划线分离纯化。同时，将分离纯化到的细菌接种于血平板培养基。 1.3 细菌的保种与复苏 挑取已纯化的单个菌落转接到BHI液体培养基，于28℃恒温培养48h，加20%甘油于-86℃保种。复苏时将保存于菌种置于冰上15min，用接种环挑取冻存管内的少量菌液分别在BHIA和血平板培养基上划线培养48h。 1.4 人工感染试验 用BHI液体培养基分别培养好分离到的两株细菌，28℃培养48h，菌液计数。用无菌蒸馏水将菌液浓度调整为1.0×108CFU/mL。NN和HP两分离菌株分别设腹腔注射组和浸泡感染组，另设空白对照组，共5个试验组。每组20尾健康斑点叉尾鮰所有试验鱼在攻毒前均在实验室内饲养30d，连续10d未出现死亡，并且用血平板培养基对脑、肝脏、脾脏和肾脏进行细菌分离培养为阴性），加水50L，腹腔注射组为每尾腹腔注射0.2mL菌液，浸泡感染组为水箱中倒入20mL菌液并搅匀，空白对照组为每尾腹腔注射0.2mLBHI培养基。连续充气，每两天换掉2/3的水，水温控制在22℃～26℃，每天按鱼总体重2%分两次投料。试验时间为30d，每天观察并记录好进食量、发病症状及死亡数。同时利用BHIA培养基对濒临死亡和死亡的斑点叉尾鮰脑、肝脏、脾脏和肾脏进行细菌分离培养和鉴定。 1.5 形态学观察及生理生化鉴定 将细菌纯化培养后，挑取单菌落革兰氏染色和负染，分别使用光镜和电镜观察细菌的个体形态、大小和鞭毛结构。生理生化鉴定委托广西进出口检验检疫局进行。 1.6 16S rRNA基因PCR扩增及序列测定 取1.5ml培养好的菌液，TIANGEN DNA抽提试剂盒提取总DNA。用于16S rDNA的PCR反应的引物是Messick等报道的通用引物对fD1/rD1［5］，该引物能扩增大多数真细菌近乎全长的16S rRNA基因，由大连宝生物公司合成。引物序列如下：fD1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；rD1：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。PCR反应体系（50）为：10×PCR缓冲液（含Mg2+）5μL，dNTP（5mmol/L）1μL，引物各1μL，模板DNA40μl，Taq酶0.25μl（5U/μl），加ddH2O至50μL。PCR程序为：94℃预变性5min；94℃ 1min，55℃1min，72℃15min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物纯化和测序由宝生物工程（大连）有限公司完成。 1.7系统发育分析 将所得1461bp序列（GenBank登录号：DQ985469）在GenBank中进行BLAST搜索，利用DNAStar50软件进行序列同源性分析和系统发育进化树的构建。
2 试验结果 2.1细菌分离纯化 在BHIA培养基上经过48h培养，从南宁和合浦两地发病斑点叉尾鮰的脑、肝脏、脾脏和肾脏均分离到NN和HP两株细菌，菌落均为针尖大小，圆形，表面光滑，透明。BHI液体培养基经56h培养，静置后试管底部有白色菌体沉淀物，轻微振荡可形成丝状物悬浮。同时发现，细菌在BHIA培养基上传代生长不良。两株细菌在血平板初代和传代生长均很好，并产生溶血现象。含20%甘油的菌液于-86℃保存两个月后可在血平板上复苏。 2.2人工感染实验 人工感染实验结果见图2，腹腔注射后5d内，NN和HP两菌株均可造成试验鱼全部死亡。NN菌株浸泡感染组斑点叉尾鮰从第4d开始死亡，第11d停止，累计死亡率为55%；HP菌株浸泡感染组斑点叉尾鮰在感染后的第6～9d出现死亡，累计死亡率为30%。在整个试验过程中（30d），对照组斑点叉尾鮰均未发生死亡。同时，注射和浸泡感染组死亡斑点叉尾鮰的脑、肝脏及肾脏均分离到对应的NN和HP菌株。因此，分离到NN和HP两菌株能使健康的斑点叉尾鮰致病，人工感染斑点叉尾鮰出现的症状与自然发病斑点叉尾鮰症状大致相同。前期（占总死亡数的90%以上）：吃食，反应迟钝；死鱼腹部明显膨大，鳍条基部，尤其是胸鳍基部有出血点，背部深色皮肤出现淡白色斑点，眼球严重突出，鳃丝苍白有出血点；解剖时，腹腔内充满大量水样液体，肝脏、脾脏和肾脏均严重肿大，体积大约为原来的两倍，肝脏出血并有灰白色坏死斑，胃显著膨大，肠道扩大，内充满黄色水样液体。后期：未见腹部膨大，皮肤出现水肿和溃烂，头部出现一开放性病灶，形成典型的“头穿孔”症状；肝脏和肾脏肿大，脾脏大小正常，肝脏灰白色坏死斑增多；胃膨大，肠道内充满黄色水样液体。 2.3 形态学观察结果 经革兰氏染色和负染（图2与图3），发现细菌为革兰氏阴性短杆菌，细菌大小在0.6～2.5μm间，菌体周围未见鞭毛结构。 2.4 生理生化指标 经BBL Crystal细菌鉴定系统的生化试验以及细菌微量检定管的补充生化试验，两株细菌的生理生化指标见表1。所测定的42项形态及生理生化指标中，NN和HP两菌株的特征完全一致。参照世界动物卫生组织《水生动物疾病诊断手册》第三版［4］，比较了NN和HP两菌株与爱德华氏菌属中的各菌种（鮰爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌和保科爱德华氏菌）参照株的D甘露醇、蔗糖和海藻糖等9个重要指标（结果见表2），NN和HP两菌株与斑点叉尾鮰肠败血症病原菌鮰爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）完全一致。结合分离菌株的培养特征、发病症状及解剖病变，初步将分离到的NN和HP两菌株鉴定为鮰爱德华氏菌。 表1 菌株NN和HP的生化指标
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性； 表2 爱德华氏菌属各菌种重要指标差异*
注：*伯杰氏细菌手册**28℃时有微弱的运动性，Hawke（1979）
2.4 分离菌株16S rRNA基因扩增及测序 NN和HP两菌株16S rRNA基因PCR扩增电泳结果如图4，其目的条带大小均约为1500bp。PCR产物经DNA双向测序，两序列长度均为1461bp（去除引物序列），并且碱基组成完全一致。所得序列已登录到GenBank，登录号为DQ985469。 2.5 分离菌株系统发育进化分析 通过互联网NCBI，在GenBank中进行Blast相似性搜索，发现与爱德华氏菌属的16S rRNA基因序列聚类，最相近的4条序列均为鮰爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri），紧接着是迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和保科爱德华氏菌（Edwardsiella hoshinae）。分别选取遗传距离较近的爱德华氏菌属各菌种的代表菌株构建系统发育进化树（图5），进行系统分类学分析，各参比菌株数据列入表3。从中可以看出，分离菌株与两株鮰爱德华氏菌构成进行分枝，4株迟缓爱德华氏菌构成另一进化分枝，而保科爱德华氏菌单独分枝。所得序列与韩国报道的鮰爱德华氏菌JCM1680菌株相似性最高（993%），所以将分离到的NN和HP两菌株鉴定为鮰爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri。
表3 系统发育分析的代表菌株和16S rRNA基因样品信息表
3 小结与讨论 经人工感染试验，从南宁和合浦两地发病斑点叉尾鮰中分离到的NN和HP两株细菌对健康斑点叉尾鮰有较强的致病和致死作用，人工感染出现的症状与自然发病症状相同。另外，人工感染发病和死亡的斑点叉尾鮰均能分离到单一菌株，其形态和生化特征分别与NN和HP两菌株完全一致，而对照组斑点叉尾鮰不发病，也未分离到任何细菌。以上结果符合生物学柯赫法则［6］，证明NN和HP两菌株对斑点叉尾鮰有致病性。同时，本研究采用常规生理生化指标测定和分子生物学16S rRNA基因两种鉴定方法对分离到两株细菌进行了分类学鉴定，两种方法结果一致，NN和HP两株细菌均鉴定为鮰爱德华氏菌。另外，两株细菌感染斑点叉尾鮰出现的症状与Newton J.C.描述斑点叉尾鮰肠型败血病（ESC）症状一致［7］，后期病鱼头部出现了ESC典型的“头穿孔”示病症状。因此，本研究在国内首次从病原学证实了ESC在广西斑点叉尾鮰养殖中流行，虽然有记载在广东、湖北、湖南、四川、河南、河北及重庆等地均已发现ESC，但都是以发病症状为判断依据，未对病原进行分类学鉴定。 斑点叉尾鮰已被我国农业部列为产业化开发的三大优质鱼类品种之一。广西斑点叉尾鮰的养殖近几年来得到迅猛发展，养殖面积和养殖产量逐年扩大和提高，鱼产品除小部分内销外，大部分加工出口。但是，在大力发展养殖斑点叉尾鮰的同时，病害也伴随而来，危害逐年加大。据调查，每年由疾病造成的直接经济损失数百万元，导致养殖专业户损失巨大。因此，及时采取科学有效的方法来预防和控制疾病的发生对我区斑点叉尾鮰产业的健康发展显得非常重要。确定病原和准确诊断是控制病害发生的前提，根据本研究室近两年对广西各地斑点叉尾鮰养殖疾病调查和本研究结果，ESC是造成广西斑点叉尾鮰大面积发病死亡的主要原因，同时，由迟缓爱德华氏菌引起的爱德华氏菌病也不容忽视。但临床早期现场诊断中往往易将这两种疾病混淆，两者的发病症状和内脏器官病变有很多相似。本实验发现，鮰爱德华氏菌感染也可引起肾脏型迟缓爱德华氏病出现的病鱼肛门红肿，以肛门为中心形成丘状突起［8］这一症状。不过，笔者观察发现，ESC病鱼的胸鳍基部会出现明显的出血点，而迟缓爱德华氏菌病或嗜水气单胞菌病常常引起病鱼各鳍均出现大面积弥散性出血或充血。 此外，鮰爱德华氏菌还可感染犀目鮰、黄鮰、黑鮰和云斑鮰，黑鲈、金体美鳊鱼、鳙等也可被感染发病，白鲇鱼和褐色鲇鱼中也曾分离到该菌［9-11］。肖克宇等［12］报道，1996年从白板综合症（white abdomen syndrome）的病鳖肝、肾中分离到鮰爱德华氏菌，并通过分离的C9605菌株进行感染试验表明为相应感染症的病原菌。同时，本菌在池水中可存活8d，在底泥中18℃可存活45d，25℃时在池塘底泥中稳定，可存活90d以上［13］。因此，该细菌可能是多种水生生物的病原菌，对水产养殖可以产生较大危害，应引起生产和科研工作者足够重视。笔者认为减少养殖密度和饲喂专用的鱼类饲料，改善养殖环境是健康养殖斑点叉尾鮰的重要保证。虽然成本有所增加，但是病害减少，产量、效益、利润自然提高。
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最后更新日期：2007年09月04日 主办单位: 广西水产研究所、广西水产学会 桂ICP备05010854号 、 桂ICP备010030号
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