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罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立陈明1 余晓丽1 李莉萍1 陈汉忠2 徐增辉2 雷爱莹1 梁万文1 黄维义2 (1广西水产研究所南宁530021； 2广西大学动物科学技术学院南宁530005)
摘要 近年来，海豚链球病已给我国及世界罗非鱼养殖带来了巨大的经济损失。为建立特异、敏感、快速的罗非鱼海豚链球菌PCR诊断方法，根据NCBI数据库已公布的海豚链球菌基因序列，设计合成种特异性引物CM1／CM2，进行海豚链球菌特异基因片段的PCR扩增试验、反应条件的优化及不同检测材料的比较。同时测试了方法的特异性和敏感性，对不同养殖鱼场的10份临床样品进行了检测。试验结果表明，引物CMl／CM2可以扩增到与预计大小相符的870bp海豚链球菌特异性基因片段；PCR反应与鮰爱德华氏细菌、Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌和河弧菌水产常见病原菌均无交叉反应；能够检测的最低细菌数为20～30个海豚链球菌；同时，该PCR可以直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织扩增出特异性目的片段；临床菌株检测结果与基于菌株16s rRNA基因序列系统进化分析结果一致。由于病鱼内脏组织总DNA、菌落及菌液可直接用于该PCR扩增，最大限度缩短了整个检测时间及降低了检测成本。方法的建立为致病性海豚链球菌检测提供了一种简便、快速的途径，具有较好的应用前景。 关键词 海豚链球菌 PCR 罗非鱼 诊断
罗非鱼为全球主要经济鱼类之一，普遍具有食性杂、生长快、抗病力与抗逆性强、肉质好、繁殖力强、适应环境强、易养殖、群体产量高等一系列优点。现己成为南方各省出口型养殖规模最大的鱼类，产量占世界75％。然而近年来，由于高密度饲养，种群退化，加上养殖水质、环境及气候恶化，各类病害时常大面积爆发，已严重影响到罗非鱼产业的健康发展 ［1、2］。根据国内外报道和本试验室研究发现，链球菌病是罗非鱼养殖病害中最常见的疾病，每年由链球菌引起的世界水产渔业的经济损失高达100亿美元 ［3］。病原分类研究表明，海豚链球菌是其中最主要的病原菌，其引起的发病率在30％～50％之间，而死亡率几乎为100％ ［4］。 目前，国内检测海豚链球菌仍然采用传统的形态学、染色和生化试验进行鉴定，花费时间长，而且灵敏度和特异性都难以满足快速检测和生产上的需要。国际水生动物疾病诊断参考实验室认为，同已有的细菌生化鉴定和免疫学检测方法相比，PCR技术能够解决大多数有关敏感性和特异性的问题，其在水产疾病诊断领域具有广阔的应用前景 ［5］。本研究采用PCR方法对罗非鱼海豚链球菌进行快速检测，旨在为实际生产中罗非鱼链球菌病的治疗和控制提供有用的诊断依据。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株 罗非鱼海豚链球菌株和鮰爱德华氏菌株由广西水产研究所分离鉴定保存，其他菌株均从中国科学院水生生物研究所购买。所有菌株信息如附表。 附表 实验菌株信息
注：黄杆菌培养基(AOA)：胰蛋白胨0.05％，酵母浸汁0.05％，乙酸钠0.02％，牛肉浸汁0.02％，琼脂1.0％，pH7.2～7.4。 牛脑心培养基(BHIA)：牛脑浸粉0.5％，牛心浸粉1.0％，胰蛋白胨1.0％，葡萄糖0.2％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％(固体培养基)。pH6.8～7.2。 1.1.2试剂 TaqDNA聚合酶(5U／μL)、dNTPs(25μM)为宝生物工程(大连)有限公司产品，DNA抽提试剂盒和胶加试剂盒为TIANGEN产品，其它化学试剂为国产分析纯级。PCR采用美国GeneAmp PCR System 9700核酸扩增仪。 1.1.3引物 本文采用Mata［6］发表的一对引物，预计扩增片段为870bp，并由上海生工生物工程技术有限公司合成，上下游引物序列分别为：CM1：5’-AAG GGG AAA TCG CAA GTG CC-3；CM2：5’-ATA TCT GAT TGG GCC GTC TAA-3’。 1.2方法 1.2.1细菌DNA的提取 将柱状黄杆菌接种于AOA培养基，其余细菌均接种于BHIA培养基，28℃培养48h后，用生理盐水稀释菌落。刮取的菌液按TIANGEN公司细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明进行抽提，DNA样于-20℃保存备用。 1.2.2 PCR反应及产物测序 反应在25μl体系中进行：10x buffer(无Mg2+)2.5μl，MgCI 2(25mM)1.5μl，dNTP(各25mM)0.5μl，引物各(25μM)0．5μl，模板1.0μl，Taq DNA Polymerase(5U／μL)0.25μl，ddH2O18.75μl。循环参数：94℃预变性4min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35次个循环；最后72℃延伸5min，于4℃结束反应。同时用1.0μl ddH2O替代模板设为空白对照。PCR扩增后所有产物在10％琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色，紫外线下观察、拍照，分析PCR扩增产物。用胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收纯化目的PCR扩增产物，宝生物工程(大连)有限公司进行DNA序列双向测定。 1.2.3 PCR反应条件优化 主要从Mg2+浓度和退火温度两方面进行调整来优化PCR扩增条件，Mg2+设有1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM 5个浓度；退火温度设有55℃、55.4℃、56.1℃、57.2℃、58.6℃、59.8℃、60.5℃、61℃8个温度。按上述PCR体系进行扩增，取6μ1PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳、染色及图象分析。 1.2.4 PCR反应特异性试验 阳性菌株为本试验从发病罗非鱼脑组织分离，通过形态学、生理生化特性及16s rRNA基因序列系统进化分析鉴定为海豚链球菌(序列在NCBI的登录号为DQ985468)。选取鮰爱德华氏细菌、Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌9种水产常见病原菌作为对照病原。所有细菌DNA按上述方法抽提，按最佳PCR体系和反应程序进行PCR扩增。 1.2.5 PCR敏感性试验 挑取单个菌落接种于LB液体培养基，28℃培养24h后进行细菌计数，取10μl菌液以10X进行梯度稀释，分别取1μl各稀释梯度的菌液依照得到的最佳反应条件进行PCR扩增，测定模板最低检出量，以能扩增出特异性片段的最高稀释度判定该PCR方法的敏感性。 1.2.6检测材料选择试验 分别选取菌液DNA、病鱼肝脏组织总DNA、菌液、菌落4种为检测材料，其中菌液DNA、病鱼肝脏组织总DNA、菌液在进行PCR扩增时，PCR反应体系不变(参照结果22)，但模板分别为1μl的菌液DNA、病鱼肝脏组织总DNA、菌液；菌落在进行PCR时，PCR反应体系中ddH2O增加1μl，最后用牙签挑取单个菌落于总PCR体系中作为扩增模板。 1.2.7 内脏组织检测 应用所建立的PCR诊断方法陆续对5尾海豚链球菌诊断为阳性的罗非鱼脑、肝脏、肾脏、脾脏和肌肉组织分别进行细菌分离和直接特异PCR检测，同时设空白对照(模板用ddH2O代替)。感染罗非鱼脑、肝脏、肾脏、脾脏和肌肉组织总DNA抽提按试剂盒说明操作。该试验旨在了解病原菌在感染罗非鱼内脏各器官的分布和检出情况。 1.2.8 临床菌株检测 应用所建立的PCR诊断方法分别对南宁和横县发病罗非鱼和斑点叉尾鮰分离到的9株链球菌进行检测，同时将诊断结果与对应分离菌株的16s rRNA基因序列分类分析结果及生化鉴定(委托广西出入境检验检疫局进行)结果进行比对。
2 结果 2.1 PCR扩增及序列测定 以分离鉴定的海豚链球菌DNA为模板，经PCR扩增和凝胶成像系统观察，发现在预期870bp处出现了目的片段(图1)。PCR产物经纯化和DNA双向测序，得到一条870bp的核苷酸序列(序列已发表在NCBI数据库，登录号为EFl26045)。序列同源性分析发现，所得核苷酸序列与引物设计模板序列(S.iniae lctP＆lct0 genes，Y07622)对应片段同源性为100％。同时在NCBI数据库进行Blast搜索，测序所得序列仅与模板序列具有很高的相似性。以上结果表明，该PCR可以准确扩增出海豚链球菌基因组特异性目的片段。
2.2 PCR反应条件的优化 当Mg2+浓度为2.5mM时，退火温度设有55℃、55.4℃、56.1℃、57.2℃、586℃、59.8℃、60.5℃、61℃，通过电泳发现当退火温度在56.1℃时，其PCR产物条带最亮，并且没有非特异性条带，因此选择56℃作为最佳退火温度；当退火温度为56℃，Mg2+浓度设有1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM5个浓度。琼脂糖凝胶电泳发现Mg2+浓度为2.0mM时，目的条带最清楚，并无非特异性条带产生。所以最终确定退火温度为56℃，Mg2+浓度为2.0mM。 最终确定的PCR体系为：10×PCR Buffer(无Mg2+)2.5μL，MgCl2(25mM)20μL，dNTP(各25mM)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U／μL)0.25μL，模板1.0μL，引物(25μM)各0.5μL，加灭菌三蒸水至25μL。PCR反应程序为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环，72℃延伸5min。 2.3 特异性试验 以海豚链球菌DNA和9种其它常见鱼类致病菌株DNA为模板，按上述筛选到的最佳体系和循环参数进行PCR扩增。电泳结果(图2)显示，该PCR反应只从海豚链球菌DNA扩增出870bp特异性基因片段，其它菌株均未扩增出相应片段，表明本试验所用引物具有较好的特异性。 M：DL2000 DNAMarker；1：海豚链球菌；2-10：鮰爱德华氏细菌、Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌 2.4 敏感性试验 通过对细菌计数，原始菌液浓度为2.3×10.6个／μL。对各稀释梯度的菌液进行PCR扩增发现，当菌液浓度稀释到2.3×10.6个／μL时，电泳图泳道6显示方法还能检测出目的条带，但当菌液浓度稀释到2.3个／μL时，电泳图泳道7显示方法未能检测出目的条带。因此，所建立的PCR方法能够检测的最低细菌量为20～30个海豚链球菌。 2.5 检测材料选择试验 分别以菌液DNA、病鱼肝脏组织总DNA、菌液、菌落4种为PCR扩增模板，在确定的最佳反应体系和反应程序进行PCR扩增。电泳染色发现菌液DNA、病鱼肝脏组织总DNA、菌液、菌落4种材料均扩增出对应的海豚链球菌特异性目的条带，结果如图4。 2．6 内脏组织检测结果 通过对5尾海豚链球菌分离为阳性临床病鱼的肝脏、脾脏、脑、肾脏及肌肉组织总DNA进行海豚链球菌特异PCR扩增，结果4份脑组织检测为阳性，1份脑组织检测为阴性，检测出率为80％；肝脏、脾脏和肾脏组织检测均为阳性，检出率为100％；而5份肌肉组织和空白对照均为阴性。图4为其中1尾内脏组织检测结果。
2.7 临床菌株检测结果 通过对临床分离的9株链球菌(6株来源于罗非鱼，3株来源于斑点叉尾鮰进行海豚链球菌特异片段PCR扩增，结果如图5。其中5株诊断为海豚链球菌，与其对应的16s rRNA基因序列分类分析结果一致(其中CGX株16s rRNA基因序列已在NCBI公布，登录号为DQ985468)；另1株的16s rRNA基因序列(NCBI登录号为EF092913)分类分析结果显示为半乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；其余3株(均来源于斑点叉尾鮰)在16s rRNA基因序列测定时失败，无法进行分类分析。然而对9株分离菌株进行生化鉴定，均未能鉴定到种，从而未能进行比较。 3 小结与讨论 S.iniae链球菌呈全球性分布，在水产养殖业中是一种严重的传染性病原菌。世界许多国家和地区的罗非鱼养殖均遭受S.iniae链球菌病影响，如中国，日本，以色列，澳大利亚，美国和许多中东国家。S.iniae链球菌除了感染罗非鱼和杂交罗非鱼，还感染多种海淡水养殖鱼类如日本鲆、鳗及虹鳟等 ［3，7，8］。此外，S.iniae链球菌还可以在不同种鱼类之间传播，混合养殖中受S.iniae链球菌传染的可能性更大。此外，S.iniae链球菌除感染鱼类，还会因操作不慎随伤口感染人类 ［9-12］。然而，目前我国罗非鱼链球菌病的诊断仍然采用传统方法对病原菌进行分离及鉴定，所需的时间比较长，准确性差，很难确诊，这种被动的局面导致了罗非鱼滥用抗生素，直接影响到了我国罗非鱼的出口创汇。因此，建立S.iniae链球菌特异、敏感、快速检测方法，不仅可以对水产养殖链球菌病进行监测和早期诊断，采取针对性有效措施减少经济损失，提高我国罗非鱼的出口竞争力和信誉度；同时可以避免抗生素滥用，对人类健康和环境监测均具有重要意义。 据国外报道，能造成鱼类链球菌病的菌株主要为S.iniae、S.difficile、S.agalaciate和S.shiloi四株 ［13，14］，感染罗非鱼的主要是S.iniae和S.agalaciate［15-17］两种。本实验室2006年先后从广西各地的发病罗非鱼分离到6株链球菌，通过16s rRNA基因序列测定和系统进化分析，其中5株为S.iniae链球菌，1株为S.agalaciate链球菌，并且通过攻毒试验发现，S.iniae链球菌株的致病性显著比S.agalaciate链球菌株强。因此，S.iniae链球菌病是罗非鱼链球菌病中危害最为严重，并且也是其中最为常见的一种。本研究针对S.iniae链球菌基因序列设计引物建立种特异性PCR诊断方法，特异性强，与嗜水气单胞菌等水产养殖常见病原菌无交叉反应，并且还能够区分S.agalaciate链球菌，在临床检测中可以一步鉴定到种，弥补了生化等常规细菌鉴定方法的不足。 本方法可从患病鱼体的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织直接检出S.iniae链球菌基因组特异片段，其中肝脏、肾脏及脾脏检出率高于脑组织，本实验室在进行S.iniae链球菌分离株攻毒试验时也发现，急性死亡罗非鱼的肝脏、肾脏及脾脏组织均能分离到S.iniae链球菌，但脑组织有时未能分离S.iniae链球菌，而亚急性和慢性病鱼均能从脑组织中分离到S.iniae链球菌。因此，推断S.iniae链球菌是随着病程推移，最终在通过脑屏障到达脑组织大量繁殖，从而使病鱼中后期出现转圈和狂游症状。 本文所建立的PCR方法在选材上有三种选择，一是直接取病鱼脑、肝脏、肾脏及脾脏组织，进行总DNA抽提和PCR反应检测S.iniae链球菌特异性基因片段。该方案避免了细菌分离纯化等繁琐程序，同时采回的病样可在-20℃较长时间保存，整个检测过程快速、方便，最快可在3h内完成。但由于细菌未经体外培养扩增，所以在体内细菌量很少时，不易检出；方案二是首先对病鱼脑、肝脏、肾脏及脾脏组织进行细菌分离，直接用菌落或扩大培养的菌液作为PCR扩增材料；另外，以抽提的菌液总DNA作为PCR扩增模板。后两种选择通过细菌在体外大量培养扩增，所以检出率较高。但由于检测程序较多，花费时间较长，并且受外界污染的机率也较大。因此在临床检测时，可根据实际情况选取相应的检测材料。 传统细菌鉴定方法程序繁琐，时间长，费用高；同时对菌属中各菌种生理生化特性要有详细的认识；并且对鉴定工作者的要求也非常高。所以在研究相对薄弱的水产病害行业，利用该方法很难将许多水产病原菌鉴定到种。自动化细菌鉴定仪在人类病原菌和兽类病原菌鉴定上的应用己非常普遍，并且有效。其原因是当前对人类病原菌和兽类病原菌的研究有很长历史，建立起较完整的专业病原数据库。而自动化细菌鉴定仪用于水产病原菌的鉴定，因缺乏较好的专业病原数据库，所以很难将临床致病菌株鉴定到种。本文建立S.iniae链球菌PCR检测方法，其临床菌株检测结果表明，该方法与通过16s rRNA基因序列测定和系统进化分析结果一致，具有快速、准确、敏感和方便等特点。
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