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斑点叉尾鮰肠败血症（ESC）PCR诊断方法的建立*

 

梁万文1，陈明1，余晓丽1，李莉萍1，陈汉忠2，徐增辉2，雷爱莹1，甘西1，黄维义2

（1.广西水产研究所530021；2．广西大学动物科学技术学院530005）

 

摘要由鮰爱德华氏细菌引起的肠败血症(ESC，又称爱德华氏病)是影响斑点叉尾鮰养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病，本研究以NCBI公布的鮰爱德华氏细菌eip基因(GeneBank登录号为AF037441)为模板序列，设计种特异性诊断引物，成功建立了用于斑点叉尾鮰肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明，该方法能够直接从发病斑点叉尾鮰脑、肝、脾和肾组织中检测到鮰爱德华氏菌，检测的最低量为21个细菌；同时，该诊断方法与I型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交叉反应。临床样品检测证明，本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾鮰肠败血症的快速诊断。

关键词斑点叉尾鮰鮰爱德华氏细菌肠败血症PCR诊断方法

 

水产病害是制约水产养殖业发展最主要的因素之一。据统计，美国水产养殖业每年因各种病害造成的经济损失高达10亿美元［1］。在各种水产病害中，由鮰爱德华氏细菌引起的肠败血症是阻碍美国南部斑点叉尾鮰养殖业发展最重要的疾病［2-4］。鮰爱德华氏菌是肠杆菌科的一员，棒状，兼性厌氧，氧化酶反应阴性，能分解葡萄糖，亚硝酸反应为阴性，是一种革兰氏阴性细菌［2-5］。由该菌引起肠败血症的发病机理至今还不很清楚。最近的研究表明，鮰爱德华氏菌有多个潜在的毒力因素，包括细菌表面的多聚糖［6-7］、脂多糖［8-10］和外膜蛋白［11-13］。

    为了有效预防该病的发生，建立一种快速、准确，并可用于早期诊断的病原检测方法对控制疾病和减少经济损失是非常必要的［14］。按照传统方法，通过细菌分离和生化指标分析是发现和鉴定该细菌的主要方法。但这一方法所需时间最少48个小时，当诊断结果出来时，该病已经在鱼群中大量传染扩散［15-16］。随着分子生物学技术的发展，国外将实时定量PCR技术应用于该病的早期快速诊断。研究结果表明，这些方法的应用对控制该病的发生具有较明显的效果［15］。

目前，我国斑点叉尾鮰养殖病害发生频繁，尤其肠败血症危害严重，随之而来的药物滥用，导致药物残留，养殖环境恶化，鱼产品质量安全下降，出口受阻，已影响我国斑点叉尾鮰养殖业的发展［17-18］。因此，急需开发一种快速、准确、敏感，并可用于斑点叉尾鮰肠败血症早期诊断的病原检测方法，做到病害的早发现，早治疗，早控制，减少病害损失，促进我国斑点叉尾鮰养殖业的健康、稳定、持续发展。

 

1材料与方法

1.1试验鱼及菌种来源

病鱼来源：从广西南宁邕江养殖斑点叉尾鮰网箱取典型症状的病鱼。

菌株来源：爱德华氏菌和海豚链球菌为广西水产研究所渔业病害防治研究室分别从斑点叉尾鮰和罗非鱼分离鉴定保存，菌株分别命名为Edwardsiella ictaluri CGX-NN-001和Streptococcus iniae CGX-NN-001；其它对照菌株购于中国科学院水生生物研究所。所有菌株具体信息如附表。
　

附表                         实验菌株信息

   菌株编号        菌种名称（所引起的病名）      培养基     最适温度
  ____________________________________________________________________

   E.i-CGX-NN-001            鮰爱德华氏菌（肠败血症）               BHIA           25-28℃
                             Edwardsiella ictaluiri

      W81-11                    Ⅰ型荧光假单胞菌                  普通           25-28℃
                         Pseudomonas fluorescent biotype I

     ST78-3-3            点状产气单胞菌点状亚种（打印病）         普通           25-28℃
                          Aeromonas punctata sub.punctata

      E-3-11                  鳗孤菌（鳗鲡弧菌病）                普通           25-28℃
                               Vibrio anguillarum

     CR79-1-1                温和气单胞菌（败血症）               普通           25-28℃
                                Aeromonas sobria

      58-20-9              肠型点状产气单胞菌（肠炎菌）           普通           25-28℃
                         Aeromonas punctata f.intertinalis

      YCX-01                  柱状黄杆菌（烂鳃病）                   AOA           25-28℃
                             Flavobacterium columnare

     XS91-4-1                 嗜水气单胞菌（暴发病）              普通           25-28℃
                               Aeromonas hydrophila

     WY91-24-3                  河弧菌（暴发病）                  普通           25-28℃
                                Vibrio fluvialis

      DMA1-A                  豚鼠气单胞菌（败血症）               普通          25-28℃
                                 Aeromonas caviae

   S.i-CGX-NN-001             海豚链球菌（链球菌病）               BHIA          25-28℃
                               Streptococcus iniae
　

表注：
    普通培养基配方：蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钠0.5％，牛肉膏0.5％，琼脂1.5％(固体培养基)。pH7.2-7.4，6.8kg灭菌20min。
    黄杆菌培养基配方(AOA)：胰蛋白胨0.5％，酵母膏0.05％，乙酸钠0.02％，牛肉膏0.02％，琼脂0．9％(固体培养基)。pH7.2-7.4，6.8kg灭菌20min。
    牛脑心培养基配方(BHIA)：牛脑浸粉0.5％，牛心浸粉1.0%，蛋白胨1.0％，葡萄糖0.2％，NaCl0.5％，琼脂2.0％(固体培养基)。pH6.8-7.2，6.8kg灭菌20min。
　

1.2试剂与仪器

Taq DNA聚合酶和dNTP为北京天为时代产品，DNA抽提试剂盒为TIANGEN产品，其它化学试剂为国产分析纯级。PCR采用美国GeneAmp PCR System 9700核酸扩增仪。

1.3细菌DNA提取

按附表所列培养基培养好各细菌(液体)，按TIANGEN DNA抽提试剂盒说明书进行总DNA提取。

1.4组织DNA提取

分别取病鱼的脑髓、肝脏、脾脏、肾脏组织，按1∶10(w／v)加入TE缓冲液，剪碎后用玻璃器匀浆，然后按试剂盒说明书进行总DNA提取。

1.5PCR引物设计

根据已发表的鮰爱德华氏细菌eip基因序列(GeneBank登录号为AF037441)，利用0ligo6.1软件设计鮰爱德华氏细菌的种特异性引物CM3(位于基因序列的1975—1995位)和CM4(位于基因序列2230—2250位)，预计扩增片段为276bp。并由上海生工生物工程技术有限公司合成。引物序列为：

    CM3：5-TCA TCA CAT CAT CTA GCG ATT-3
    CM4：5-CTT TAC ACA GAT AGG CGA TAC-3

1.6 PCR反应试验

反应在25μl体系中进行：10×buffer 2.5μl，MgCl21.0μl，dNTP0.5μl，引物各0.5μl，模板1.0μl，Taq DNA Po1ymeras0.25μl，ddH2O18.75μl。循环参数：94℃预变性2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃45s，循环扩增32次，最后72℃延伸2min，于4℃结束反应。PCR产物电泳及分析。

1.7PCR反应条件优化

主要从MgCl2的浓度和退火温度两方面进行调整来优化PCR扩增条件。MgCl2的浓度梯度分别为1.5mol/l、2.0mol/l、2.5mol/l、3.0mol/l；退火温度梯度分别为55℃、55.4℃、56.1℃、57.2℃、58.6℃、598℃、60.5℃、61℃。取6μlPCR产物，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线下观察、拍照，分析PCR扩增产物。

1.8PCR产物测序

直接将PCR产物送至大连Takara公司进行DNA双向测序，测序结果在NCBI进行Blast搜索比对，同时利用生物软件进行序列分析。

1.9特异性试验

温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌、豚鼠气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、河弧菌及海豚链球菌DNA在同一PCR反应体系中进行扩增，检测该PCR方法特异性。

1.10敏感性试验

取一定培养好的菌液进行稀释，在固体培养基上进行菌落读数，并取一部分计数好的菌液按试剂盒操作说明书进行总DNA抽提，10倍梯度连续稀释DNA样品。按上述PCR反应的最佳反应条件进行PCR扩增，测定模板最低检出量。并通过换算计算出所建立的PCR诊断方法最低能检测出多少个鮰爱德华氏细菌，从而判定该PCR方法的敏感度。

1.11临床样品检测

应用所建立的PCR诊断方法分别对南宁邕江某网箱养殖发病斑点叉尾鮰的脑、肝、脾及肾组织总DNA进行PCR扩增；同时，对桂林、合浦及贵港发病斑点叉尾鮰分离到的细菌进行PCR诊断。
　

2结果

2.1PCR扩增结果

以分离鉴定好的鮰爱德华氏菌DNA为模板，经PCR扩增和凝胶成像系统观察，发现在预期276bp处出现了目的片段。

2.2PCR反应条件优化结果

首先优化退火温度，当MgCl2的浓度为2.5mmol/l时，退火温度梯度为55℃、55.4℃、56.1℃、57.2℃、58.6℃、598℃、60.5℃、61℃，通过电泳发现当退火温度在58.6℃时，其PCR产物条带最亮，并且没有非特异性条带，因此选择59℃作为最佳退火温度；再调整MgCl2的浓度，MgCl2的浓度梯度为1.0mmol/l：1.5mmol/l、2.0mmol/l、2.5mmol/l、3.0mmol/l。琼脂糖凝胶电泳发现MgCl2在2.5mmol/l时，目的条带最清楚，并无非特异性条带产生。所以最终确定退火温度为59℃，MgCl2浓度为2.5mmol/l。

    最终确定的PCR体系为：10×PCR Buffer(无Mg2+)2.5μl，MgCl2(25mmol/l)2.5μl，dNTPs（25mmol/l）0.5μl，Taq DNA聚合酶0.25μl（5U/μl），模板1.0μl，引物（100pmol/μl)各0.5μl，加灭菌三蒸水至25μl。PCR反应程序为：95℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃30s，32个循环，72℃延伸5min。

2.3测序结果与序列分析

PCR产物经DNA双向测序，得到一条276bp的核苷酸序列。序列分析发现，所得核苷酸序列与引物设计模板序列eip基因对应片段同源性为100％。

2.4特异性试验结果

以鮰爱德华氏细菌DNA和10种其它常见鱼类致病菌菌株DNA为模板，按上述优化的最佳体系和循环参数进行PCR扩增。电泳结果显示，不能从其它10种常见鱼类致病菌株扩增出276bp的DNA片段，表明本研究所设计的引物具有较好的特异性。

2.5敏感性试验结果

对不同稀释度的鮰爱德华氏细菌DNA进行PCR扩增，结果显示，第5泳道为检测最低值，其对应的模板DNA量为0.106ng，通过细菌计数和换算，所建立的PCR方法能够检测的最低细菌量为21个鮰爱德华氏菌。

2.6临床检测结果

应用所建立的PCR诊断方法分别对南宁邕江某网箱养殖发病斑点叉尾鮰的脑、肝、脾及肾组织总DNA进行PCR扩增；同时，对桂林、合浦及贵港发病斑点叉尾鮰分离到的细菌进行PCR诊断。诊断结果显示，该方法能够从患病斑点叉尾鮰的脑、肝、脾及肾组织直接检测出鮰爱德华氏细菌；另外，从合浦发病斑点叉尾鮰鱼苗分离到一株细菌也诊断为鮰爱德华氏细菌，而桂林和贵港分离到的两株细菌并非鮰爱德华氏细菌。 

3讨论与分析

1976年在美国的亚拉马州和佐治亚州的河鮰鱼中首次发现鮰鱼肠败血症，随后ESC成了美国南部对鮰鱼养殖业危害最大的传染病。大多数由鮰鱼爱德华氏菌引起的疾病报道的对象都是斑点叉尾鮰，但在北美的鮰鱼包括犀目鮰，黄鮰，黑鮰和云斑鮰也能分离到该细菌。世界动物卫生组织《水生动物疾病诊断手册》第三版已将叉尾鮰肠败血症(爱德华氏病)列入水生动物重要疾病之一。国内有关斑点叉尾鮰病害的研究报道不多，但据养殖人员反映，近几年来，我国斑点叉尾鮰养殖从鱼苗到成鱼均出现病害的暴发，病害的发生己严重威胁了斑点叉尾鮰养殖业的健康发展。目前国外已报道的诊断方法主要是细菌的分离鉴定和血清学两类方法。但由于该细菌生长缓慢，因此用细菌分离鉴定方法对该病进行诊断，花费时间较长，不能满足临床需要。单克隆免疫荧光和酶免疫染色有较好的特异性和敏感性，对大量鱼群进行普查而言很有价值。但由于其不能区分康复鱼，所以在日常诊断中很少应用。本研究针对斑点叉尾鮰肠败血症病原鮰爱德华氏细菌eip基因设计了一对编码276bp的诊断引物CM3和CM4。特异性试验和敏感性试验结果显示，该方法特异性好，与水产常见病原菌没有交叉反应，可检测的最低量为21个鮰爱德华氏细菌。同时，该PCR诊断方法直接以

    鮰爱德华氏细菌DNA为检测对像，可用来直接检测脑、肝、脾及肾组织中鮰爱德华氏菌的存在，很大程度上简化了诊断程序和缩短了检测时间，弥补了细菌分离鉴定和血清学方法的不足。因此，建立的该PCR方法在生产和检测上有很好的推广应用前景。

目前我国有一些斑点叉尾鮰病例的报道，怀疑是感染鮰爱德华氏细菌所致的肠败血症。但还未见鮰爱德华氏细菌的分离鉴定报道，也没有PCR诊断方法建立的报道。不过，本研究室已从患病斑点叉尾鮰脑组织中分离到一株致病性细菌，并从分子水平鉴定其为鮰爱德华氏细菌(待发表)。同时，本研究室研究表明，斑点叉尾鮰肠败血症在广西发生频率高，从鱼苗到成鱼均出现过大面积爆发；流行时间跨度较大，3月到11月均可发生该病，但高峰期在7月和9月；已严重影响广西斑点叉尾鮰产业的发展。因此，建立准确、快速检测斑点叉尾鮰爱德华氏细菌的方法是非常紧迫和必要的。但要对斑点叉尾鮰肠败血症进行有效的预防和治疗，还需对该病的病原学、流行病学、免疫学进行深入的研究，为今后疫苗的研究奠定基础。

 

主要参考文献

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 * 基金项目：广西科学研究与技术开发计划基金资助项目（0639036）

　

　

　

　

　

　

 最后更新日期：2007年04月12日

主办单位: 广西水产研究所、广西水产学会

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