 |
|
|||||||||||||||
|
罗非鱼海豚链球菌16s rRNA基因的序列测定和系统进化分析* 甘西1，陈明1，余晓丽1，李莉萍1，陈汉忠2，徐增辉2，雷爱莹1，梁万文1，黄维义2
(1.广西水产研究所广西南宁530021； 2.广西大学动物科学技术学院广西南宁530005)
摘要为了从分子水平上对一株来源于发病罗非鱼的链球菌进行分类学鉴定，本研究利用原核生物16s rRNA基因通用引物对该菌株进行了16s rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5kbp目的片段，测序得到一条长度为1447bp核苷酸序列。核苷酸同源性分析表明，该序列与NCBI公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16s rRNA基因核苷酸序列同源性最高(99.4%)，暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时，亲源关系较近的S.iniae、S.difficile和S.agalaciate代表菌株构建的系统发育进化树显示，该菌株与S.iniae代表菌株组成同一进化分支，与S.agalaciate代表菌株组成的另一进化分支距离较近(95.5%)，而与S.difficile代表菌株组成的进化分支距离较远(92.3%)。本研究证实，从发病罗非鱼脑组织分离得到的致病性链球菌为海豚链球菌。 关键词罗非鱼海豚链球菌16s rRNA克隆系统发育进化树
罗非鱼系热带鱼类，原产于非洲，广泛分布于非洲大陆的淡水、咸淡水水域。目前已成为中国最具产业化发展前景的养殖鱼类之一。广西养殖罗非鱼，不论是养殖面积还是产量，均居全国前列。但近两年来，罗非鱼链球菌病在广西呈暴发性流行，无论是网箱，还是池塘养殖的罗非鱼，都有此病发生，使罗非鱼的生产遭受了很大的损失。病鱼主要表现为眼球突出，通常单边眼睛角膜出现混浊变白，游姿平衡失调、转圈，肠空并充满淡黄色液体，肝脏肿大等。该病发病率一般在20%～30%，死亡率达95%以上。 据国外报道，造成鱼类链球菌病的菌株主要是S.iniae、S.difficile、S.agalaciate和Sshiloi四种［1-3］，感染罗非鱼的主要是S.iniae和S.agalaciate［4-6］。国内在这方面的研究较少，柴家前等［7］从发病的罗非鱼体内分离得到一株G+链球菌，并通过形态特性、生化指标和理化特性对该菌进行了初步鉴定。沈智华等［8］也从红拟石首鱼分离到一株致病性链球菌，并利用国外报道的链球菌种特异性PCR检测方法将其鉴定为海豚链球菌。 鉴于国内对罗非鱼链球菌病流行菌种的鉴定主要采用传统方法，而传统方法往往很难将其鉴定到种或亚种，并且所需时间较长，花费高。因此，本研究以原核生物中具有重要分类学意义的16s rRNA基因为研究对象，对分离到的一株罗非鱼致病性链球菌进行该基因的克隆与序列分析，旨在从分子水平上对分离到的细菌进行分类学地位研究，将其鉴定到种，从而了解广西罗非鱼养殖业中链球菌病的流行菌种，为今后该病疫苗的研制及防治奠定基础。
1材料和方法 1.1病原来源 广西南宁邕江某网箱养殖场发病的罗非鱼。 1.2工程菌和质粒 E.coli DH5 α由广西水产研究所渔业病害防治研究室保存，克隆载体pMD18-T购于大连宝生物工程有限公司。 1.3主要试制 Tap聚合酶、dNTP、Trizol、氨苄青霉素(Amp)、氯仿、苯酚购于上海生工生物工程技术服务有限公司；DNA抽提试剂盒为TIANGEN产品，胶回收试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司。 1.4引物 选择Messick等报道的通用引物对fD1/rD1［9］。该引物能扩增大多数真细菌近乎全长的16s rRNA基因，由大连宝生物公司合成。引物序列如下： fD1∶5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ rD1∶5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’ 1.5基因组抽提 取1.5ml培养好的菌液，按TIANGEN DNA抽提试剂盒说明进行总DNA提取。 1.6PCR扩增 反应在50μl体系中进行：10×buffer 5.0μl，dNTP 1.0μl，fD1 1.0μl，rDl 1.0μl，模板1.0μl，Taq DNA Polymeras 0.5μl，ddH2O 39.5μl。PCR循环参数：94℃预变性5min；然后94℃45sec，55℃45sec，72℃1.5min，循环扩增35次；最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。 1.7PCR产物电泳及胶回收 配制含琼脂糖1.0%的凝胶，在5V/cm条件下电泳40min，接着在溴化乙锭(EB)中染色10min，然后在紫外光下将目的带切下，按上海华舜胶回收试剂盒说明进行胶回收。 1.8基因克隆与鉴定 利用T-A连接，按pMD18-T载体说明书将纯化的PCR产物直接连接于pMD18-T载体中，按常规方法转化到E.coli DH5 α感受态细胞，挑选白斑，接于含有Amp的LB培养基过夜培养。取1.5ml培养物用于质粒抽提，然后进行酶切(Eco RⅠ和HindⅢ)和PCR鉴定。 1.9测序及序列分析 挑选阳性克隆送大连宝生物工程有限公司进行DNA双向测序。同时利用DNAMAN分析软件将测序所得的S.iniae-CGX 16s rRNA基因核苷酸序列与GenBank上收录的S.iniae、S.difficile和S.agalaciate代表菌株16s rRNA基因核苷酸序列进行同源性比对和系统进化树的建立。各代表菌株如表1所列。
2结果 2.1PCR扩增结果 以提取的S.iniae-CGX菌株基因组为模板，fD1和rD1为引物，扩增出一条约为1.5kbp的目的片段，结果如图1（略）。 2.2PCR产物的克隆与鉴定 PCR纯化产物与pMD18-T载体连接、转化，扩增培养后进行质粒抽提，以所得质粒DNA为模板，酶切(Eco RⅠ和Hind Ⅲ)和PCR鉴定结果见图2和图3（略）。
表1系统发育分析的代表菌株和16s rRNA基因样品信息表
菌种 宿主/菌株 Gen Bank登录号 文中编号 _____________________________________________________________________ 罗非鱼/Siniae-CGX 鲑鱼/ATCC29178 AF335572S.iniae-1 S.iniae虹鳟鱼/Dan 1 AF335573S.iniae-2 青蛙/SCCF5L AY762259S.iniae-3 人/ATCC 29178 DQ303187 S.iniae-4 _____________________________________________________________________ S.difficile未注明/GTC 2049 AB175036 S.difficile-1 未注明/GTC 730(T)AB112407 S.difficile-2 _____________________________________________________________________ 人/2603V/R AE014202 S.agalaciate-1 S.agalaciate人/ATCC 13813 DQ303183S.agalaciate-2 牛/JCM 5671 AB023574 S.agalaciate-3
2.3测序结果 挑选阳性克隆经DNA双向测序，结果得到一条长度为1447bp(已去除引物序列)的近乎全长的16s rRNA基因片段。所得序列已登录到GenBank，登录号为DQ985468。 2.4序列分析结果 经过与GenBank中已知的各种微生物序列进行相似性搜索表明。测定序列与国外报道的海豚链球菌ATCC29178菌株16s rRNA基因序列相似性最高，同源性为99.4%。同时通过与常造成鱼类链球菌病的S.iniae、S.difficile和S.agalaciate三种链球菌代表株16s rRNA基因序列进行核苷酸同源性分析，测定序列与S.iniae代表菌株的同源性最高(99.4%)，与S.agalaciate代表菌株的同源性次之(95.5%)，与S.difficile代表菌株的同源性只有92.3%。核苷酸同源性分析结果如表2。
表2 核苷酸序列同源性分析结果
2.5系统进化分析结果 用于系统进化分析的病原体是本研究室分离到的罗非鱼海豚链球菌(S.iniae-CGX)和GenBank中收录的S.iniae、S.difficile和S.agalaciate三种链球菌代表株的16s rRNA基因序列(表1)。同源性进化分析结果如图4（略）。
3讨论 罗非鱼是世界上主要的养殖鱼类，由于养殖中受到细菌的危害而遭受严重损失，链球菌是罗非鱼细菌病最主要的病原。美国每年因链球菌病造成的损失已超过1.5亿美元［10］，中国罗非鱼养殖量约占世界的1/2以上，并且受病害影响比美国更加严重，估计该病每年在中国造成的经济损失远远超过1.5亿美元。然而，罗非鱼的死亡和疾病有70%是S.iniae链球菌引起［10］，同时造成饵料利用率下降和败坏养殖水质。S.iniae链球菌在全球分布很广，是一种严重的传染性病原菌。S.iniae链球菌病影响到许多国家和地区的罗非鱼养殖，如中国，日本，以色列，澳大利亚，美国和许多中东国家。S.iniae链球菌除了感染罗非鱼和杂交罗非鱼，还感染多种淡水及海水养殖鱼类如日本鲆、鳗及虹鳟等［10-12］。此外，S.iniae链球菌还可以在不同鱼类之间传播，混合养殖中受S.iniae链球菌传染的可能性更大。另据报道，S.iniae链球菌除了感染鱼类，还会因操作不慎随伤口感染人类［13-16］。 本研究克隆的16s rRNA基因为原核生物核糖体RNA基因的一种，大小适中，约1.5kbp左右，由可变区和恒定区交叉排列构成。其序列既体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家及分类学家所接受［17］。所以，细菌系统学研究特设委员会建议依据系统发育关系分类。利用16s rRNA通用引物(原核生物16s rRNA常用通用引物如表3［9］)，对细菌16s rRNA进行PCR扩增、克隆和测序，对不同细菌的16s rRNA进行同源性比较与分析，可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近。16s rRNA分析技术与传统微生物鉴定技术的主要区别在于：①该方法不依赖于微生物的分离培养，是一种非培养分析技术，能够快速鉴定出那些目前尚不能人工培养的微生物；②该方法的鉴定指标单一明确，以保守的16s rRNA序列为基准，通过找到序列差异鉴定种属，可以发现微生物新的种类，而传统技术必须综合大量的指标加以鉴定，常规PCR检测也必须已知微生的特异基因序列。因此该技术在微生物学研究中逐渐得到广泛应用。基于此，本研究利用原核生物16s rRNA基因将从罗非鱼和斑点叉尾鮰分离的链球菌鉴定到种。 表3比较常用的16s rRNA基因PCR扩增通用引物
引物1序列2(5’-3’) 适用范围 fD1ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTCAC大多数真细菌 fD2ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCATGGCTCA肠道细菌及其相关细菌 fD3ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTTAGSpirochetes疏螺旋体 fD4ccgaattcgtcgacaacAGAATTTGATCTTGGTTCAG衣原体属 rD1cccgggatccaagcttAAGGAGGTGATCCAGCC许多真细菌 rP1cccgggatccaagcttACGGTTACCTTGTTACGACTT肠道细菌 rP2cccgggatccaagcttACGGCTCCTTGTTACGCTT大多数细菌 rP3cccgggatccaagcttACGGATACCTTGTTACGACTT梭杆菌
1．引物缩写：f:正向r:反向D：远端P：近端，带f的包含Eco RⅠ和SalⅠ的位点；r包含HindⅢ和Bam H Ⅰ和Xmal I识别序列；反向引物产生rRNA的互补序列；rP1、rP2、rP3除从3’端开始的第17个碱基不同外全部相同。 2．所有引物序列方向都从5’-3’，连接序列包含用小写字母写的克隆用酶切位点。
本研究鉴定的细菌来源于罗非鱼和斑点叉尾鮰混合养殖的发病罗非鱼。当时，发病罗非鱼的主要症状有三点：1在水面单方向打转；2眼球突出，并且单边眼球呈白色混浊 ；3鱼嘴周围严重出血。通过细菌分离，从脑、肝、肾、脾均分离到单一的链球菌。一周后，同一网箱养殖的斑点叉尾鮰也出现了类似症状，经细菌分离，也从脑、肝、肾、脾分离到单一的链球菌。罗非鱼的发病率在30%左右，死亡率超过90%，斑点叉尾鮰的发病率较高，超过50%，死亡率几乎为100%。通过对分离到的两株链球菌进行16s rRNA基因的克隆测序，发现两株链球菌的16s rRNA基因序列完全一致。以上研究结果说明从斑点叉尾鮰和罗非鱼分离到的两株链球菌均为同一株S.iniae链球菌(S.iniae-CGX)。因此，感染罗非鱼的S.iniae链球菌可以感染斑点叉尾鮰，并可造成较为严重的发病死亡。这一研究结果表明，S.iniae链球菌很可能成为感染斑点叉尾鮰的一种新病原菌，将给斑点叉尾鮰养殖造成严重危害。 本研究通过16s rRNA基因进行系统进化分析表明，分离到的链球菌与国外分离到的三株S.iniae链球菌(鲑鱼/ATCC29178、虹鳟鱼/Dan1、青蛙/SCCF5L、人/ATCC29178)构成一个进化分枝，而两株S.difficile链球菌(GTC2049、GTC730(T))和三株S.agalaciatel链球菌(人/2603V/R、人/ATCC13813、牛/JCM5671)分别组成另两个进化分枝。因此，从分类学角度分析，易造成鱼类链球菌病的几种链球菌的种间差异在16s rRNA基因序列上得到了体现，这一研究结果为今后从基因水平建立快速鉴定这几种细菌的方法提供了重要的理论依据，同时也解决了我国以鱼类链球菌病病原菌分类一直不清楚这一问题。总之，本研究为认清我国罗非鱼和斑点叉尾鮰链球菌病流行菌株的分类、今后链球菌病PCR快速诊断方法的建立及其免疫疫苗的研究提供了可靠的试验数据，也为最终控制我国鱼类链球菌病奠定了基础。 另外，海豚链球菌引起的鱼类疾病，不仅对渔业生产造成危害，而且对食品安全和人类健康构成了威胁［13-16］，对链球菌病原的诊断、检测和防治值得人们的高度重视。因此，有必要对分离到的致病性S.iniae链球菌进行深入研究。
参考文献 ［1］Yin Z,Xu B H.Studies on the bacteriosis of fishes［J］.Acta Hydrobiologica Sinica.1995,19(1):76-83 ［2］Weinstein M R,Litt M,Kertesz D A,et al.Invasive Infections Due to a Fish Pathogen,Streptococcus iniae［J］.N.Engl.J.Med.1997,337:589-594 ［3］Eldar A,Bejerano Y,Bercovier H.Streptococcus shiloi and Streptococeus difficile:two new streptococcal species causing a meningoen cephalitis in fish［J］.Curr.Microbiol1994,28:139-143 ［4］Perera R,Johnson S,Collins M,et al.Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica and Tancea hybrids［J］.JoulTtal of Aquatic Animal Health.1994,6:335-340 ［5］Pier G,Marlin S.Streptococcus iniae sp.nov,a beta—hemolytic streptococcus isolated from an Amazon fresh water dolphin,Inia geoffrensis［J］.1nt.J.Syst.Bacteriol.1976,26::545-553 ［6］Eldar A,Perl S,Frelier P E,et al.Red drum Sciaenops ocellatus nortalities associated with Streptococcus iniae infection［J］.Dis.Aquat.Org.1999,36:121-127 ［7］沈智华，钱冬，许文军等.红拟石首鱼海豚链球菌分离、鉴定及致病性研究［J］.水生生物学报.2005，29(6)：678-683 ［8］柴家前，丁巧玲，王振龙.罗非鱼链球菌的分离鉴定［J］.中国预防兽医学报.2002，24(1)：18-20 ［9］Messick JB,Berent LM,Cooper SK.Development and evaluation of a PCR-based assay for detection of Haemobartonella felis in cat and differentiation of H.felis from related bacteria by restriction fragment length polymorohism analysis［J］.J Clin Microbiol.1998,36(2):462-466 ［10］Shoemaker C.A,Klesius P.H,Evans J.J,et al.Prevalence of Streptococcus iniae in tilapia,hybrid striped bass,and channel catfish on commercial fish farms in the United States［J］.AJVR.2001,62:174-177 ［11］Colorni A,Diamant A,Eldar A,et al.Streptococcus iniae Infections in red sea cage-cultured and wild fishes［J］.Dis.Aquat.org.2002,49:165-170 ［12］Zlotkin A,Hershko H,Eldar A.Possible transmission of Streptococcus iniae from wild fish to cultured marine fish［J］.Appl.Environ.Microbiol.1998,64:4065-4067 ［13］Durborow R M.Health and safety concerns in fisheries and Aquaculture.Occup.Med. 1999,14:373-406 ［14］Lau S K P,Woo P C Y,Tse H,et alInvasive Streptococcus iniae infections outside North America［J］.J.Clin.Microbiol.2003,41:1004-1009 ［15］Lehane L,Rawlin G T.Topically acquired bacterial zoonoses from fish:a review.Med.J. Aust.2000,173:256-259 ［16］Weinsten M R,Litt M,Kertesz D A,et al.Invasive infections due to a fish pathogen,Streptococcus iniae.S.iniae study group.N.Engl.J.Med.1997.337:589-594 ［17］焦振泉，刘秀梅.16s rRNA序列同源性分析与细菌系统分类鉴定［J］.国外医学卫生学分册.1998，25(1)：12-16
* 基金项目：广西科学研究与技术开发计划基金资助项目(0639036)
|
|
最后更新日期：2007年01月05日 主办单位: 广西水产研究所、广西水产学会 桂ICP备05010854号 、 桂ICP备010030号
|