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黄曲霉毒素分析方法进展
李区 (广西水产畜牧学校南宁530021)
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黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题。自20世纪60年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道，以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素。因此，寻求准确、快速、简便的检测方法，对黄曲霉毒素进行高效的定性定量的分析，是黄曲霉毒素研究的一个重要方面。
1黄曲霉毒素研究概况 黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出20多样，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q1、H1、GM1和毒醇。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃香豆素衍生物，在紫外光下，黄曲霉毒素B1、B2发蓝紫色荧光，G1、G2发黄绿色荧光。黄曲霉毒素M1是B1在体内经过羟化而生成代谢产物。黄曲霉毒素耐热，可溶于氯仿、甲酸、丙酮等有机溶剂，不溶于水、石油醚、己烷和乙醚。在一般中性及酸性溶液中较稳定，在pH9～10的强碱性溶液中迅速分解。黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。 由于黄曲霉毒素是一类毒性极强的剧毒物质，1993年被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，表现为肝细胞变性、坏死、最终导致器官严重损伤。其中B1、B2、G1、G2是最主要的毒素物质，而B1是自然发生潜力最大的一种毒素。
2黄曲霉毒素的检测分析方法 黄曲霉毒素的分析方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种普遍应用，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测分析提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求。 2.1薄层层析法(TLC) TLC法是检测黄曲霉毒素的最常用方法，最初的TLC法针对不同的样品，用适宜的提取溶剂把黄曲霉毒素从样品中提取出来，经柱层析净化，再在薄层板上展开层析分离，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。 王宏亮对国际GB/T5009·22-1996所规定的方法进行了部分改进，在利用CCl4抽提前，加入质量分数25%的醋酸铅溶液和质量分数4%的NaCl溶液，再用CCl4振动抽提，于薄层板点样后展开时，先用CCl4丙酮的混合液正向展开，然后用无水乙醚进行反向展开，回收率为76.9%，最低检出限量为5×10-9，改进后的方法进一步排除了蛋白质杂质，使提取与净化效果增强，在薄层双向展开时组分分离也更安全，AFTB1形成的斑点易观察，操作简便，但增加了操作步骤。 为了提高薄层层析法的精度，建立薄层扫描法来确定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同，只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。杨焱等把粉碎过筛的样品加水湿润后通入氯仿过滤，取滤液在65℃水浴上挥干，再用苯一乙腈溶液转移；通过点板，用乙醚预展后，再用氯仿一丙酮(92：8)展开，在365nm紫外光下观察，根据AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2分别显示的蓝紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光，在扫描仪上绘制AFT扫描图谱，并由此分辨出黄曲霉毒素种类；最后作定量分析；以斑点面积积分值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，得到样品的AFT浓度。 2.2高效液相色谱法(HPLC) HPLC法主要是用荧光检测器检测，在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱，使多样黄曲霉毒素同时分离。该法快速而准确，但需要昂贵的仪器设备。 林奕芝研究将AFTB1进行柱前衍生，采用三氟乙酸将AFTB1衍生成AFTB2，应用HPLC-FLD(美国惠普检测器)，在激发波长365nm，荧光波长450nm，流动相甲醇—水为体积1∶1，流速1.0ml/min，色谱柱为Hypersul，ODS条件下，测定AFTB1衍生物，得到了AFTB1浓度与峰面积良好工作曲线，相关系数r=1.000，精密度、准确度好，灵敏度高，回收率达到95%～101%，检出限为0.2ng(2×10-10g)。宋欢采用佛罗里硅土净化柱净化，三氟乙酸柱前衍生检测饲料中AFTB1，回收率为83%，相关系数r=0.9998。文镜采用国产硅镁吸附柱层析分离纯化玉米中AFTB1，用HPLC法检测方法简便，纯化效果好，最低检出量0.08ng(8×10-11g)，回收率为92.87%，该法制柱方便，而且降低了成本。 2.3微柱法 微柱法测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365nm紫外光下显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素含量成正比关系，由此简略定量黄曲霉毒素。 陈达民通过微柱法采用以下步骤测定黄曲霉毒素：先把粉碎过20目筛的样品放在碘价瓶中，加入石油醚和甲醇溶液，给瓶塞上涂上一层水，盖严防漏，放在振荡器上振荡；等静置分层后，用快速定性滤纸过滤，用移液管吸取甲醇溶液并加入氯仿，再静置分层，将氯仿提取液经无水硫酸钠脱水过滤，加入制好的微柱管中，待加液流至顶层时，加入氯仿—丙酮(9∶1)展开剂展开，流完后即可在365nm紫外光下观察结果，有微黄色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根据其荧光强度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量。 2.4酶联免疫吸附法(ELISA) 酶联免疫吸附法是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大致采用两种方法检测黄曲霉毒素，一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞争法。 Holladay等采用间接ELISA技术，检测了抗黄曲霉毒素M1—牛血清白蛋白(AFM1-BSA)免疫原的特异性AFM1抗体。为了使用方便，利用酶联免疫原理研制出黄曲霉毒素快速测试盒，能简便地定量测定黄曲霉毒素含量。赵晓联等应用这种快速测试盒测定黄曲霉毒素含量，先用三氯甲烷提取样品，过滤，收集并水浴挥干提取液，再以甲醇(5∶5)溶解，最后用专用黄曲霉毒素试剂盒测定。 2.5其他方法 超光谱(HS)方法是基于反射能基础上的一种非侵入无破坏的映像技术，用于农产品检测中，能够快速地提供该产品的有关化学和其他方面的内部细节。David Casasent等尝试性地用它来检测玉米中黄曲霉毒素含量，但它似乎能更好地用于霉菌识别。进一步地开发利用还有待于解决HS特征选择的最优化问题。另据研究报道，培训黄蜂可用于黄曲霉毒素检测。由于黄曲霉毒素主要是由黄曲霉产生的，寄生黄蜂通过培训能把黄曲霉的气味和糖水联系起来，并对这些气味产生有区别的行为反应，借此来识别目标气味的存在。这种培训反应正在应用于储藏玉米、花生的黄曲霉毒素监控和检测实践中，目前还未给出有关的结果评定。
3各种检测分析方法的比较 TLC法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间多，易受杂质干扰，较适合于对AFT的定性检测，是研究AFT2初期所使用的主要方法。虽然薄层层析法在不断地改进，并在一般实验室均可完成操作，但由于它复杂的前处理过程致使在应用中仍然会受到一定程度的限制。 HPLC法测定AFT，技术水平要求较高，目前采用这种方法检测AFT较多，但具体一次实验所使用的化学药剂和处理途径差别很大，对实验结果的精度造成影响，这种方法还应在实践中进一步改进。总体上说HPLC法操作较为简便，同时可检测多个AFT种类，适合于大批量样品的分析。将免疫亲和柱与HPLC法结合应用，是目前采用较多的一种方法，今后将被广泛应用。 微柱法测定AFT，主要是用来检验AFT的存在与否以及快速筛选出超标样品，而要对AFT种类进行区分定量检验，则需要对不同AFT组分进行分离，再利用其他方法检测。因此，微柱法并不能完成整个AFT检测过程，仅适用于定性检验。 ELISA法操作简便，使用较为安全，但由于酶本身的不稳定性，用此方法检验AFT有可能带来假阳、阴性结果，而且研制出来的AFT快速测试盒多以测定其毒性的种属为主，食品和饲料工业上利用它来界定食品或饲料中AFT的超标问题。ELISA法的检测精度还有待提高。 AFT特有的极大危害性和广泛分布，给环境安全部门提出了一系列尖锐问题。为分析AFT提供方便和快捷的手段，达到及早预防和去除AFT污染的目的，还应研制探索新的检测方法，研制一种简便、快速、灵敏、准确、廉价的分析方法是当务之急的课题。
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