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电子报刊

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   广西水产科技

  2003年第1期（总第106期）

 

鱼类细胞体外培养及其应用

郑春静     张 铭

(浙江省宁波市水产研究所 315010)  (浙江大学生命科学学院  杭州  315010)

 

细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术，在生物领域中越来越占有重要的地位。动物细胞的培养已有上百年的历史。鱼类细胞培养开始于1962年Wolf和Quimby首次建立虹鳟RTG?2细胞系以后。1980年国外统计数据表明有61株细胞系来自36种鱼属于17属［1］。目前已经建立的鱼类细胞系包括淡水鱼和海水鱼，至少有157种［2］。我国80年代已建立了十余种细胞株(系)。其中主要以淡水鱼细胞培养为主。近几年随着海水养殖业的高速发展，海水鱼细胞培养也越来越受重视。至1999年仅中科院海洋所一家单位就已建立海水鱼类细胞四株，牙鲆鱼鳃细胞系、鲈鱼脾细胞系、鲈鱼心细胞系、真鲷鳍细胞系。鱼细胞培养广泛应用于鱼类，特别是基于细胞培养技术的鱼类胚胎干细胞的研究对于基因打靶技术在鱼类发育生物学、鱼类基因工程育种及水产生物技术的应用具有重要意义［3］。

 

1鱼类细胞培养

1.1鱼类细胞系(株)

鱼类细胞培养的概念和培养技术基本上借用哺乳动物细胞培养。细胞培养可分为原代细胞培养和传代细胞培养两大类。原代细胞培养是指直接从动物的组织器官获得细胞所作的首次培养，而传代细胞培养则体外生长的细胞进行扩大和继代。

细胞系或细胞株是已经命名的、经过细胞生物学鉴定的，形态比较一致，生长增殖比较稳定，生物学性状清楚的细胞群［4］。

1.1.1细胞建系技术

1.1.1.1原代细胞培养

组织来源：鱼的很多组织器官可用于细胞培养。胚胎组织及幼鱼的组织器官，由于其分化程度低，分裂潜能大，是原代细胞培养的主要来源。幼鱼的性腺、肾、心、鳔、脾、鳍条、吻端等也是常用的材料，尤以性腺和肾应用最广。

组织块固定法：当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约1mm3的小块，按一定比例将组织块贴在瓶壁上，至少30min以上，然后轻轻加入营养液置温箱培养。

机械分散法：适用于细胞间连接较松散的组织，如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约1mm3的小块，放入底部有一铜网的注射器内，用手的压力将组织挤出网孔，最后将分散的组织吹打后加入营养液分装培养。

络合剂分散法：目前使用的络合剂主要是EDTA(乙二胺四乙酸)，它能与细胞间的Ca 2+、Mg2+结合而使细胞连接松散，经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培 养及上皮型细胞系的传代。

酶消化法：该法是目前采用极为广泛的方法，适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶，常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同，又可进一步分为冷消化法及热消化法。冷消化法是将组织剪成约2mm3的小块，然后置5～20倍体积的胰酶中，4℃越夜(16～18h)；热消化法酪作用的温度通常是15℃～20℃，作用时间30～60min。消化完成后，弃胰酶，加入营养液吹打，最后分瓶培养。

1.1.1.2传代细胞培养

原代细胞经5～10d培养长成单层后，就要进行传代扩大。将营养液弃去，用0.05%胰酶—0.02%EDTA混合消化液洗涤后，再加入适量该液消化，所用温度与细胞培养温度相同，一般为20℃。当大多数细胞变圆后，加入营养液吹打，最后分瓶培养。

1.1.1.3细胞培养中的关键技术

细胞培养已在许多实验室广泛开展，但由于细胞培养是在体外模拟机体内的生理环境来进行细胞的增殖，故而要求有较为严格的条件，如温度、二氧化碳浓度、pH值和一定的营养条件等。

细胞培养要求无菌操作。无菌是细胞培养成功的首要条件，其常规要求一般的操作者都可以做到。但某些细节问题应特别引起重视：1)进入无菌室操作前必须将培养瓶外表消毒；2)提防试剂瓶中的液体浸湿瓶盖，这往往是试验污染的重要因素之一；3)严禁操作时手在各 种器皿上方经过，并尽量保持皿口水平或倾斜，可大大降低污染［5］。

作为动物细胞培基重要添加成分的动物血清，由于其蛋白含量高，组成复杂，批次间质量差异大，价格昂贵且有可能携带有害微生物［6］。因此，尽可能使用同一批号血清。另外，使用前血清应在56℃水浴中保持1h，以杀灭支原体。

1.1.2目前国内外主要鱼类细胞系

离体细胞培养在鱼类生物技术研究中的应用日趋广泛。鱼细胞培养技术的突破为深入研究鱼类生物学和鱼类养殖学提供了素材。根据国外资料，目前用于研究的鱼细胞系有许多，包括棕鮰Pimephales promelas)细胞BB［7］、棕鮰性腺CCO、鲫(Carassius  auratus)鳍CAR、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tschawytscha) 胚胎CHSE-214、鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤EPC、黑头软口鲦(Pimephales promelas)FHM、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺RTG-2［8］、虹鳟STE-137［9］、大鲮鲆(Scophthalmus maximus)鳍TF［10］、鲹(Caranx mate)鱼苗细胞［11］、大鳞大马哈鱼胚胎CHSE-sp［12］、鲤鱼白细胞系CLC［13］、鲫鱼巨噬细胞系GMCL［14］、SAF-1金头鲷(Sparus aurata) 细胞［15］、大鲮鲆纤维细胞TV-1［16］、PLHC-1大鲮鲆肝瘤细胞［17］、虹鳟脾组织RTS34st［18］、虹鳟肝瘤细胞［19］RTH149、虹鳟肝细胞R1［20］、太阳鱼鳃(Lepomis macrochirus)BG/G［21］、太阳鱼鳍BG/F、鲤鱼垂体CaPi［22］、太阳鱼仔鱼细胞BF-2［23］、羊鲷(Archosargus probatocephalus)细胞系［24］、银鲷(Bairdiella chrysura)SP-1［25］、虹鳟肝瘤细胞RTH-149［26］、青鳉(Oryzias latipes)OL32［27］、大西洋鲑(Salmo salar)头肾细胞LSHK-1［28］、虹鳟前肾基质细胞TPS［29］。

目前鱼类胚胎干细胞的培养在国外取得了成功，并在鱼类遗传工程研究中应用(表1)。

 

表1          鱼类ES细胞系                    

细胞名称     鱼种      组织       细胞形态   

SaBE-1c     金头鲷     胚胎     ES样细胞［30］［31］

ZEF         斑马鱼     胚胎      成纤维细胞

OLES1        青鳉      胚胎       ES样细胞

Mes1         青鳉      囊胚       ES样细胞   

 

我国最早报道的鱼细胞系有草鱼吻端组织细胞株(1981，张念慈、杨广智)，草鱼肾组织细胞系(1986，左文功等)，草鱼尾鳍组织二倍体细胞系(1986，魏彦章等)，草鱼吻端成纤维细胞系(1988，李焕林等)等。目前至少有以下几种。

 

表2         我国已建立的细胞系［32、33、34］     

细胞名称      鱼种     组织      细胞形态

ZC-7901       草鱼     吻端      纤维细胞

CIK           草鱼      肾      上皮样细胞

CAB-80        鲫鱼               纤维细胞

GOCF-2        草鱼     尾鳍      纤维细胞

PSF           草鱼     吻端      纤维细胞

GCSH          草鱼      鳔      上皮样细胞

TQ-8801      团头鲂    尾鳍      纤维细胞

HGC-87        草鱼     尾鳍      纤维细胞

HCC-87        鲫鱼    鳃盖膜    上皮样细胞

SCF           白鲢     尾鳍      纤维细胞

EG            鳗鲡     性腺      纤维细胞

FG            牙鲆      鳃       上皮样细胞

SPS           鲈鱼      脾       上皮样细胞

SPH           鲈鱼      心       上皮样细胞

RSBF          真鲷      鳍        纤维细胞

CBS         淡水白鲳   吻端       纤维细胞

CBT         淡水白鲳   臀鳍       纤维细胞

CBW         淡水白鲳   尾鳍       纤维细胞

 

1.2  鱼类胚胎干细胞研究

1.2.1胚胎干细胞的概念

胚胎干细胞的概念来自哺乳动物：胚胎干细胞(embryonicstem cell,ES)是从早期胚胎中发现、能在体外培养的一种高度未分化细胞，它具有发育成各种细胞的潜能。主要来源于两种组织：早期胚胎细胞团分离的ES细胞和胚胎生殖脊分离的胚胎生殖细胞(embryonic germcell,EG)，两者的形态、标志、体内分化潜能及种系传递功能都相似。

ES细胞在不同条件下具有不同的功能状态，它是饲养层细胞依赖的。在有抑制因子存在的条件培养基(CM)中，它呈未分化状态生长；在无抑制因子存在的培养基中，分化成各种细胞；在悬浮培养时，可形成拟胚体(embryoidbody,EB)，像早期胚胎发生有秩序地分化。

ES细胞具有发育分化成各种类型细胞的多潜能性，此种特性既可在体内发育，也可在体外诱导［35］。

鱼类胚胎干细胞的特征：细胞系在形态、碱性磷酸酶活性及分化能力等许多方面具有ES样细胞的特征。细胞小而呈圆形、细胞核占据细胞体的大部分，在细胞质中有许多液泡样结构。细胞生长活跃，形成致密包被集落。传代培养时，细胞通常占据由相邻滋养层细胞围隔形成的空隙中，围绕滋养层细胞生长。这些细胞表现出很强的碱性磷酸酶活性，而滋养层细胞的碱性磷酸酶活性很弱［36］。

1.2.2鱼类胚胎干细胞研究概况

鱼类胚胎干细胞的研究，主要应用哺乳动物小鼠的研究方法［37、38］。由于哺乳动物胚胎干细胞研究成为这几年的热点，从而引起人们对鱼类及其它动物胚胎细胞研究的重视。事实上胚胎细胞培养的研究早在70年代已有报道［39］。目前建立的鱼类胚 胎细胞系主要来自金头鲷、青鳉［40、41、42］及斑马鱼［43、44］的囊胚。

青鳉ES细胞系的建立方法(1)借鉴鼠类ES细胞的培养方法，采用成纤维细胞作为滋养细胞。Wakamatsu等［45］将青鳉桑椹期胚胎细胞团块消化分离后，以成纤维细胞作为滋养层细胞进行培养。成纤维细胞来源于青鳉囊胚和原肠胚，经过丝裂霉素处理，几次传代后，保存于液氮中待用。采用这种培养系统，成功地建立了青鳉ES样多能细胞系OLES1。(2)囊胚细胞原代培养。从青鳉囊胚期胚胎分离出卵型球囊胚细胞的直径为50um左右。3个原代培养细胞株经诱生形成3个独立的ES样细胞株。

青鳉ES细胞系性状鉴定：经20多代的连续培养后，这些细胞都表现出类似的表型、生长性状和分化能力。对其中的MES1细胞系进行细胞学重点培养和分析，该细胞系生长稳定，可以长期冷冻保存、解冻复苏后又能正常生长。MES1细胞具有哺乳类ES细胞的许多特征，细胞较大，直径10～30um，呈圆形或多边形，胞质稀少，也呈现出很强的碱性磷酸酶活性。

斑马鱼的胚胎干细胞研究也取得成功。斑马鱼的胚胎干细胞是从斑马鱼早期囊胚中分离出单个细胞进行培养。经过多次传代培养后，获得了ES样细胞系，细胞具有鼠类ES细胞的形态，并具有高的碱性磷酸酶活性。从斑马鱼胚胎分离培养出成纤维细胞，经过传代培养后，获得了斑马鱼胚胎成纤维细胞系，用丝霉素C处理后作为滋养层细胞［46］。

2 鱼细胞培养的应用

鱼类细胞培养已广泛应用于鱼类遗传学、病毒学、药物学及生物技术等多方面。包括以下几个方面：

2.1  鱼类细胞培养(特别是原代细胞培养)应用于鱼类染色体数目及形态的研究，对活体取样，所采用的细胞包括血细胞(主要是淋巴细胞)、鳍上皮细胞及鳞片上皮细胞，采取这些细胞时对活鱼损害极小。

2.2 利用ES细胞进行基因操作：(1)异源基因导入：通过显微注射、逆转录病毒介导或电脉冲介导，将 外源DNA导入，使原有基因超表达(增加功能)；或使原有基因表达减弱(降低功能)；或使原 有基因关闭(失去功能)；(2)基因重组；基因打靶，即通过同源重组，按预期方式改变遗传信息的方法。构建两种同源靶载体：序列置换和序列同源进行定位整合，通过直接或间接克隆筛选法、正负选择法(PNS)和多聚酶链反应法(PCR)等方法，将定位整合的细胞选择出来；(3)诱导基因突变；(4)用于转基因动物［47］。

2.3 鱼类嵌合体及其遗传特性的研究：动物嵌合体的制作是将ES细胞移植到受体囊胚中从而获得嵌合体动物。鱼类嵌合体制作的报道不多，而且都以囊胚细胞作为供体细胞，只有Hong等［36］将传代培养达40代的青鳉ES样细胞系(MES1)显微注射到青鳉白化品系的囊胚中，从而成功地获得了ES样细胞移植的嵌合体青鳉。另一个成功的实验是将绿色荧光蛋白(GFP)基因通过转染MES1细胞，将携带GFP基因的MES1细胞显微注射到白化青鳉囊胚中，其中的90%发育成GFP阳性鱼苗。这是利用鱼类ES样细胞系获得嵌合体的首次成功报道。

2.4 鱼类病毒学是鱼类细胞培养最主要的应用领域。美国水产学会曾4次推出的鱼类病毒病检测标准已成为国际水产界所公认的标准。在此标准中细胞培养检测鱼类病毒病一直占有非常重要的地位。用不同方法对鱼类传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)进行检测和比较，认为细胞培养检测鱼类病毒病原具有不可取代的地位［48］。细胞培养在鱼病学中的应用主要包括以下几个方面：1)病毒的分离鉴定：将可疑病料接种敏感细胞作病毒的分离培养已是鱼类病毒病的常规手段，病毒分离后再作鉴定，常用中和试验和荧光抗体技术；(2)病毒的大量增殖：细胞培养技术可在体外大量扩增病毒，进而用于病毒分子生物学研究(包括病毒分肽及基因分析)、制备抗血清(包括常规抗体及单克隆抗体)和疫苗(包括弱毒苗和灭活苗)等；(3)流行病学研究：包括病毒不同血清型及天然弱毒株的分离、比较等。

2.5 鱼细胞培养已广泛应用于药物测试，具有以下优点：(1)细胞的均一性好，在遗传上极为相似；(2)药物与细胞直接接触，可较迅速获得结果；(3)可结合多种技术方法测知药物效应；(4)比用活鱼更经济、更方便。当然，对此实验结果进行评估时应考虑到体内外环境的不同。

2.6 细胞培养法检测材料生物相容性：

这是一种快速、简便、重复性好又价廉的方法［49］，以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量的变化，近几年来研究材料对细胞生长、附着、增殖及代谢方面影响的报道日趋增多，并提出了以有活力的细胞数和细胞生长作为材料生物相容性评价标准的观点。通过结合免疫、化学、放射及影像学等多学科的技术发展，使人们进一步深入了解细胞结构和功能的变化关系，进而阐明材料对细胞的作用机制，是今后细胞培养法评价材料生物相容性的发展方向。细胞培养检测材料生物相容性的观点完全可以扩展到鱼类与水环境、养殖材料的相容性，用鱼细胞检测水环境和养殖材料质量也是切实可行的措施。

鱼细胞培养的应用越来越广泛，对鱼细胞培养技术的要求也越来越高。为了获得更多细胞，节省成本，有效控制实验条件，无血清细胞培养法及组分明确的培养基研究是不可缺少的。

目前无血清培养技术已应用于生物制品的生产(见表3)。无血清培养基中添加的蛋白成分价格昂贵，且有的成分(如牛血清蛋白)含有很多种杂质，因此，在无血清培养成功以后，科学家们又开始研究从培养基中减去这些成分。在对细胞的营养需求有比较深入认识的基础上，化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)［50］和杂交瘤细胞的培养［51］。虽然鱼类细胞培养中尚未成功应用无血清培养技术，但在这方面的研究已有一定基础［52］，相信在不久的将来鱼细胞培养技术会有所突破，更广泛地应用于研究领域。

 

表3部分已用无血清培基进行生产的生物制品［53］

产品             细胞系             培养方式

t-PA        CHO、C127、骨髓瘤细胞     悬浮

G—CSF        Namalva KIM—1

Mab              Hybridoma             悬浮

IL-2                BHK               微载体

β-GAL            Sf-9                悬浮

 

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