电子报刊

广西水产科技

2003年第1期（总第106期）

几种鲷科鱼类的线粒体细胞色素b基因序列

比较及分子系统学的分析

江世贵刘红艳 

（中国水产科学研究院南海水产研究所广州 510030）

鲷科(Sparide)属鲈形目(Percoiformes)，鲈亚目(Percoide)，为世界性的鱼类。现有记载的世界上的鲷科鱼类大致分为30多个属，而我国的鲷科鱼大致分为6～8个属，其属间和种间的系统分类关系混乱。虽然在形态学水平上做了不少工作，但有关其分类和系统仍存在较多争议。因此，从DNA水平上提供新的证据，对于澄清鲷科鱼类的分类和系统中存在的问题是十分必要的。

本文测定了分布于我国鲷科鱼类中黄鳍鲷(Sparuslatus)、黑鲷(Sparus macrocephalus)、真鲷(Pagrosomus major )和平鲷(Rhabdosargus sarba)细胞色素b基因部分片段序列，并结合GeneBanK中的黄鲷(Taius tumifrons)、灰鳍鲷(Sparus berda)、犁齿鲷(Evynnis japonica)和高背四长棘鲷(Argyrops spinifer )及外群牙鲆(Paralichthys olivaceus)的相应序列进行比较和分析，以期从分子水平探索鲷科鱼的分类和系统进化关系。

1 材料和方法 

1.1材料来源本实验分析鲷科鱼类408bp的DNA序列中，黄鳍鲷、黑鲷、真鲷和平鲷4种DNA序列通过PCR产物直接测序获得，黄鲷、灰鳍鲷、犁齿鲷和高背四长棘鲷及外群牙鲆的DNA序列来自GeneBank。材料和DNA数据的具体来源见表1。

1.2 总DNA的提取取100mg左右的鲷科鱼背部肌肉，加TEN9细胞裂解液(50mMTris clpH9.0,100mM EDTA,200mM NaCl)，终浓度为2%的SDS和终浓度为1mg/mlProtein K，混匀后，56℃消化过夜，经饱和酚，酚—氯仿(酚：氯仿：异戊醇=25:24:1)，氯仿(氯仿：异戊醇=24:1)抽提，2倍无水乙醇和1/10NaCA沉淀，70%乙醇洗涤后，用灭菌蒸馏水溶解，4℃存放。

1.3线粒体DNA细胞色素b基因片段的扩增目标片段为鲷科鱼类细胞色素b(Cytb)编码区中约430bp的一段DNA序列，采用的是一对通用引物：L14724：5’-〖KG(*3)GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，H15149：5’-CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC-3’。PCR反应总体积为50ul，其中10×ExTaq Buffer(Takara)5ul,ExTaq polymerase(Takara)0.3ul(1.5U),dNTP(2.5mM)(Takara) 4ul,10pmol/ul引物2ul,1ul模板DNA，其余为灭菌蒸馏水。扩增条件为：94℃预变性2min，之后进行35个循环(94℃ 45s,55℃ 45s,72℃ 60s)，最后72℃延伸7min。扩增产物经1.5%TAE琼脂糖凝胶回收纯化后直接进行序列测定。

1.4序列测定及数据分析回收纯化后的PCR产物送至上海基康公司(Genecore)测序。使用Clustal X(Ver5.0)排定DNA序列，并经人工核查。在此基础上，用DNASTAR软件中的Megalign计算碱基转换/颠换率和序列百分差异。用MEGA2.1中的“Neighbore-Joining”构建分子系统树，置信度由“Boot Strap”1000次循环检验^［13］，以牙鲆作为外群来比较。

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表1 鲷科鱼的DNA数据或材料来源 

Table1 The origins of DNA data or tissue samples of Sparidae fishes

鱼类名称拉丁名 形态分类 鲷科鱼或序列来源

Name of fish Scientific name Morphological txonomy Origin of Spa ridae fishe

 or sequeneces

黄鳍鲷 S.latus…………鲷科，鲷属Sparidae,Sparus 珠海东澳岛

黑鲷 S.macrocephalus 鲷科，鲷属Sparidae,Sparus 珠海东澳岛

真鲷 P.major 鲷科，真鲷属Sparidae,Pagrosomus 广州黄沙水产市场

平鲷 P.sarba 鲷科，平鲷属Sparidae,Rhabdosargus 广州黄沙水产市场

黄鲷 T.tumifrons 鲷科，黄鲷属Sparidae,Taius GeneBank(AF240786)

灰鳍鲷 S.berda 鲷科，鲷属Sparidae,Sparus GeneBank(AF240715)

犁齿鲷 E.japonica 鲷科，犁齿鲷属Sparidae,Evynnis GeneBank(AF240725)

高背四长棘鲷 A.spinifer 鲷科，四长棘鲷属Sparidae,Argyrops GeneBank(AF240717)

牙鲆 P.olivaceus 鲆科，牙鲆属Bothidae,paralichthys GeneBank(AB028664)

2 结果

2.1鲷科鱼Cytb基因片段序列及其差异

从黄鳍鲷、黑鲷、真鲷、平鲷总DNA中成功的扩增出约430bp的Cytb基因片段。PCR产物直接测序得到的碱基序列和GeneBank下载的序列，经Clastal X同源排序后的408bp序列见图2。在所有408bp序列中，没有发现碱基的缺失或插入，其中共检测到126个核苷酸位点存在变异，约占30.7%，序列中的转换大于颠换，碱基替换多发生在密码子的第三位点。

表2 鲷科鱼类细胞色素bDNA序列差异百分比(对角线以上)和转换/颠换数(对角线以下)

Table2 Percentage divergenece(above diagonal) and numbers of transitions/t ransversions(below diagonal)for cytochrome b sequeneces(408bp) of Sparide fishes 

S.latus S.macrocephalus P.major S.sarba T.tumifrons S.berda E.japonica A.spinifer

S.latus - 9.9 20.6 19.7 19.2 12.5 21.0 17.3

S.macrocephalus 33/4 - 18.6 18.8 17.0 3.8 18.6 14.8

P.major 53/19 49/17 - 15.8 16.1 18.6 6.4 10.9

S.sarba 44/26 45/22 33/25 - 21.7 19.1 17.7 18.3

T.tumifrons 47/21 44/17 44/14 49/27 - 18.6 16.5 14.6

S.berda 40/6 13/2 47/19 44/24 47/19 - 19.9 16.7

E.japonica 54/19 49/17 21/4 39/25 47/12 49/19 - 10.1

A.spinifer 46/16 40/14 32/9 40/26 42/11 44/16 31/7 -

从表2中可得出，鲷科属之间细胞色素b序列的平均差异为18.13%，鲷属3个种(黄鳍鲷、黑鲷和灰鳍鲷)之间的平均差异为8.73%，真鲷、犁齿鲷、高背四长棘鲷之间的平均差异为9.13%。序列差异最小是黑鲷和灰鳍鲷，仅为3.8%，序列差异最大的是黄鲷和平鲷，达到了21.7%。

2.2系统进化树

采用DNASTAR软件中的MegAlign程序排列DNA同源序列，并经人工核查。在此基础上采用phylogentic tree功能搜寻鲷科鱼类系统进化树(图1)，以牙鲆为外群进行比较。

图1 NJ法构建鲷科鱼类的分子系统树，数字表示Bootstrap 1000个循环的置信度

Fig1 Molecular phylogenetid tree of Spar idefishes constructed by NJ method,thenumbers show the confident values ofBootstrap 1000 indicate

3 讨论

早期Forsskal把平鲷划归 Sparus^［8］，而多数学者认为平鲷应自成一属Rhabdosargu。其实在形态特征上，平鲷属与鲷属已有了很大的分化，如头部形状、臼齿特征、背鳍和臀鳍数目有很大的差别；我们的结果中平鲷也自成单独的一支，从而说明把平鲷从鲷属中划分出来是合理的。一直以来，把黄鳍鲷、黑鲷和灰鳍鲷归为一个属并无太大争议，只是不同的学者们所用的属名不同，我们的系统进化研究也印证了这个观点，而且得出灰鳍鲷和黑鲷的亲缘关系最近，它们的序列差异仅为3.8%。

从表2(上三角)中可知，黄鲷与其它几种鲷的序列差异为16.1%～21.7%，平鲷与其它几种鲷的序列差异为14.6%～19.7%，鲷属与其它几种鲷的序列差异为14.8%～21.0%，Cronin曾报道属间的线粒体DNA的序列差异在14%～21%之间^［14］，假定以此为参考，那么分子系统树的根部4支应分别对应4属。黄鲷属、平鲷属和鲷属的分子系统分析结果与形态分类学上的研究结果相吻合。值得注意的是，传统的分类学把这犁齿鲷、真鲷和高背四长棘鲷归为3个不同的属(虽然真鲷归属问题变动很大，但是以往的归类与四长棘鲷属和犁齿鲷属都是为不同的属)，而我们的分子系统中，这3种鲷聚成一支，而且真鲷和犁齿鲷的序列差异仅为6.4%，3种鲷间序列差异最大也仅为10.9%，处于种的分化水平，序列变化处在属变化范围之内。另外在幼鱼阶段，二长棘鲷背鳍鳍棘还未延长时，真鲷的体形、体色和身体上蓝色的斑点与其都极为相似，从外形上很难把它们区分开^［7］，从而说明真鲷和二长棘鲷具有较近的亲缘关系，而最近伍汉霖等根据形态分类特征，把二长棘鲷属并入犁齿鲷属，说明真鲷跟犁齿鲷也应具有较近的亲缘关系。四长棘鲷跟二长棘鲷最根本的区别在于背鳍鳍棘延长的数目不同，从而似乎也可以推断出真鲷与四长棘鲷具有较近的亲缘关系，这3种鲷是否可以归为一个属呢?我们建议分类学家们对这3种鲷的系统分类地位作进一步考证。

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本页最后更新时间：2004年11月03日