广西水产科技

2003年第1期（总第106期）

三个不同地理群体真鲷遗传变异的RAPD分析

江世贵杨慧荣

(中国水产科学研究院南海水产研究所广州 510300)

提要 用RAPD技术对取自胶州湾、台湾海峡和北部湾3个野生群体的24尾真鲷进行群体间的遗传变异分析。在事先优化的反应条件下，在使用的60个随机引物中，有31个引物扩增出清晰稳定的片段，共计216条，大小在200-2500bp之间，其中多态性片段176条(多态性片段的比例为81.48%)。群体间的遗传距离分别是0.1645、0.1413、0.1073，台湾海峡与北部湾真鲷的遗传距离最近，胶州湾与台湾海峡其次，胶州湾与北部湾最远。

关键词 真鲷胶州湾台湾海峡北部湾遗传变异RAPD

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态DNA)是建立在PCR技术基础上的检测DNA序列多态性和建立分子遗传标记的技术，Williams^［1］等首次运用随机引物扩增寻找多态DNA片段作为分子遗传标记。Welsh^［2］等也发现以寡核苷酸作为引物对基因组DNA进行扩增，产物的图谱表现出高度的变异性。因其具有操作简单、能够快速高效地提供许多个体或基因型许多位点的DNA序列多态性数据等优点，所以它在生物的遗传多样性、群体遗传学、分类学以及农牧业的遗传育种等研究中得到了广泛的应用。

真鲷(Pagrosomus major)属鲷科(Sparide)鲈形目(Percoiformes)鲈亚目(Percoide)，为近海底层鱼类，其体色鲜艳，肉味鲜美，是一种名贵的海洋经济鱼类，也是我国海水鱼类养殖的重要对象，在我国的南海、东海和黄海均有分布。我国已经对真鲷的基础生物学和人工繁殖及养殖技术进行了大量研究，实现了规模化生产，但在分子水平对真鲷种质资源状况的研究较少，本文旨在通过RAPD技术对我国胶州湾、台湾海峡及北部湾海区3个地理种群真鲷的遗传变异及分化进行研究，以期为真鲷的种质资源研究提供相关的遗传背景资料和理论依据，为分子标记育种打下基础。

1.材料和方法

1.1材料本实验所用真鲷分别取自胶州湾(青岛，代号：qd种群)、台湾海峡(福建，代号：fj种群)及北部湾(海南，代号：hn种群)，各8尾，均为野生群体，在取样点取鱼背部肌肉冰冻运回实验室，-70℃保存。

1.2随机引物及筛选选用美国Operon公司试剂盒Kit A、Kit R与kit S共60个10bp的随机引物，在事先优化的反应条件下，筛选出清晰稳定的随机引物供统计分析，其中无扩增产物、扩增带型模糊及结果不稳定的不作分析。

1.3基因组DNA的提取每尾取约100mg背部肌肉剪碎，加入600ulTEN细胞裂解液(Tris.cl 50mM，pH9.0；EDTA 100mM；NaCl 200mM)，终浓度为2%的SDS和1mg/ml的Protein K，混匀后，56℃消化过夜，分别用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)和氯仿抽提，直至无蛋白质中间相，再用2倍体积无水乙醇和1/10体积NaCA沉淀，70%乙醇洗涤后，用无离子超纯水溶解，-20℃存放。

1.4RAPD-PCR反应 PCR反应在德国Biometra PCR仪上进行。反应总体积25ul，其中10×Taq Buffer2.5ul,Taq polymerase 0.2ul(5U/ul),dNTPs(2.5mM each)0.5ul,Mg²⁺(25mM)2.5ul，引物(10uM)2ul，模板DNA25ng，无离子超纯水15.3ul。扩增条件为：94℃预变性5min后，在进行45个循环，每一循环包括：94℃45s，36℃45s，72℃90s，最后72℃延伸10min。每次PCR反应均设不含模板DNA的空白对照。扩增产物经1.5%TBE琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，紫外灯光下检测、拍照。

1.5数据分析根据RAPD产物的电泳带型，进行群体间的比较分析。按公式S_xy=2n_xy/(n_x+n_y)计算个体间遗传相似性指数(n_xy是个体x和y的共有带数，n_x和n_y分别是个体x和y的扩增带数)。群体间的相似性指数(S_ij)为群体i中的个体和群体j中的个体随机组合所得相似指数的平均值^〔3，4〕。用公式D=1-S计算群体间的遗传距离。

2 结果与讨论

2.1RAPD图谱在供筛选的60个随机引物中，有29个引物无扩增产物或因结果不稳定不作进一步分析。其余31个随机引物在3个种群的24个个体中扩增结果稳定、重复性佳。共产生216条扩增带(平均每个引物产生7条带)，片段大在200-2500bp之间，多态性带有176条，如果以每条DNA扩增带作一座位计，则多态座位占总座位的比例为81.48%。除OPA-17、OPR-4、OPR-16、OPS-6、OPS-19为单态引物外，其余均为多态引物，多态引物的比例为83.87%。表1为筛选出的引物编号、序列和扩增结果。

表1 筛选出的引物编号、序列和扩增结果

Tab.1 The codes and squences of primers elected and amplification results

引物序列(5’—3’) 扩增座位引物序列(5’—3 ’)  扩增座位

Primers Squences(5’—3’) Amplified bands Primers Squences(5’—3’) Amplified bands

OPA-1 GTTTCGCTCC 2—8 OPR-9 TGAGCCTCAC 4—5

OPA-3 CATCCCCCTG 3—7 OPR-12 GTCCCGTGGT 6—11

OPA-4 GGACTGGAGT 4—7 OPR-16 CTGCTTAGGG 3

OPA-5 TGCGCCCTTC 4—5 OPR-18 TGGTCGCAGA 3—6

OPA-8 GTCCACACGG 4—7 OPS-1 CATTCGAGCC 5—10

OPA-11 GTAGACCCGT 5—6 OPS-2 GTCTCCGCAA 6—9

OPA-12 CCTTGACGCA 3—6 OPS-6 CACCTTTCCC 4

OPA-13 TTCCCCCGCT 2—5 OPS-10 GTGCAACGTG 3—4

OPA-14 TCCGCTCTGG 3—9 OPS-11 AATGCCCCAG 6—8

OPA-15 GGAGGGTGTT 5—10 OPS-13 GGTTGTACCC 3—4

OPA-17 AGGGAACGAG 5 OPS-14 CCCGCTACAC 4—10

OPA-20 GGACCCTTAC 4—6 OPS-16 GAGCGTCGAA 4—7

OPR-1 CCCGGCATAA 5—8 OPS-18 CCTAGTCGAG 6—11

OPR-4 CCGAACACGG 4 OPS-19 CACAGGCGGA 4

OPR-5 CTCCATGGGG 6—10 OPS-20 GTGTCGCGAG 5—11

OPR-6 TCGTTCCGCA 4—6

总座位数 109 总座位数 107

Total bands Total bands

2.2遗传距离的计算对真鲷不同地理群体间进行遗传距离分析。表2是将电泳图谱转化成“0-1”矩阵(详细数据略)后在RAPDDIST与RAPDPLOT软件上换算成的Nei氏遗传距离。群体间的遗传距离是青岛与海南最大，青岛与福建次之，福建与海南最小，遗传距离值分别是0.1645、0.1413、0.1073。可见群体间存在着较广泛的遗传变异，并且在变异的程度上存在差异，遗传距离与地理分布具有一致性。

表2 三个地理群体真鲷群体间的遗传距离

Table2 Interpopulation genetic distances in three deferent populations of Pagrosomus major遗传距离 qd种群 fj种群 hn种群

genetic distancesqd Qingdao population Fujian population Hainan population

qd种群

Qingdao p opulation

fj种群 0.1413

Fujian population

hn种群 0.1645 0.1073

Hainan population

2.3讨论真鲷广泛分布于太平洋西海岸与大洋州各国沿海。Perez?Enriquez和Taniguchi曾利用微卫星DNA标记技术研究了日本与太平洋西南部8个不同海域真鲷群体的遗传结构，认为中国至日本沿岸、澳大利亚与新西兰的真鲷分别属于三个不同的种群(population)，中国至日本沿岸真鲷又可分为三个差异较大的亚种群(subpopulation)，其中中国东海(浙江海区)与南海(广东海区)的真鲷分别属于不同的亚种群，而中国东海和黄海与日本沿海的真鲷则属同一亚种群，但日本沿海的高支海区由于受人工放流的影响，遗传结构与其它海区有明显的差异^［6］。王伟继和孔杰等^［6］运用同工酶技术研究了真鲷野生群体与养殖群体的遗传变异，研究表明真鲷的养殖与野生群体都具有较高的遗传变异，但瓶颈效应和遗传漂变导致了养殖群体遗传多样性的降低。王志勇等^［7］利用AFLP技术研究中国沿海真鲷群体的遗传变异和趋势，结果为厦门海区与北部湾海区的真鲷差异较小，黄海真鲷与前两个群体差异较大，与本文的研究结果恰好一致。

本研究的3个采样区分别是胶州湾(青岛)、台湾海峡(福建)和北部湾(海南)，且均为野生群体。从研究结果来看，同一群体的个体间都存在着较大遗传变异，少数个体的RAPD图谱显示出主要带型的缺失或各自特有的主亮带(见图1-B、C)，这一现象在24×24矩阵的遗传距离指数(详细列表略)中得到了映证：有些个体间的遗传距离指数比种群间的高，这些变异比较显著，但是在综合统计时易被忽略，而往往正是这些遗传变异才可能影响鱼类的遗传结构、种群分化乃至物种进化。胶州湾与北部湾群体的遗传差异较大，遗传距离是0.1645。从生殖习性来看，胶州湾真鲷属春季生殖，而北部湾真鲷属秋冬季生殖类型；从地理位置和气候来看，胶州湾与北部湾地处遥远，南北气候相差较大，胶州湾属温带海洋性气候，北部湾属热带海洋性气候，它们在地理条件、生态环境和繁殖习性上的较大差异直接导致了地理隔离和生殖隔离，所以在不同水系形成遗传性能上互有差异的孟德尔繁育群体，两者明显属于相互独立的不同地方种群(或称为亚种群)，Perez?Enriquez和Taniguchi的报道也支持了本文的观点。台湾海峡与胶州湾的遗传距离是0.1413，与北部湾的遗传距离是0.1073。台湾海峡与北部湾真鲷都属于秋冬季生殖类型，台湾海峡的亚热带海洋性气候与北部湾的热带海洋性气候较为接近，且两者的采样点均位于南海海区，在地理位置上相距较近，群体间的遗传距离与其地理分布具有一致性。夏德全^［8］、张四明^［9］、张锡元^［10］等分别用RAPD技术研究了大银鱼、太湖新银鱼、中华鲟、草鱼和鲢鱼不同地理群体的遗传变异，群体间的遗传距离值位于0.35-0.18之间，相比之下，本研究中真鲷的遗传距离值较高，相互之间的遗传差异较大，说明3个不同海区的真鲷是相互独立的地理群体，进一步映证了这3个海区的真鲷一般只在繁殖与育肥索饵时分别向深海与浅海区作东西向洄游，而几乎不作南北向洄游。

分类实践上物种的划分主要是根据形态差异、生殖隔离和地理分布为标准，传统的分类方法是根据形态、生殖等标准确定物种的界定。随着现代分子生物学技术的发展，人们开始用分子的手段来探索、描述并解释生物多样性及其分类和演化，生物大分子数据能为一些特定类群(如对应于传统分类中的某一科、某一属或某一种以及种下的不同亚种或居群等)的物种鉴定提供参考标准。目前分子生物学技术在不同群体的遗传鉴定、混合渔业分析、遗传多样性大小的维护和濒危物种的保护及遗传间渗监测等方面已得到了应用^［11］，将传统的形态差异、生殖隔离和地理分布与现代的分子技术相结合来研究物种的分类和演化及我国的种质资源状况，这将具有广阔的研究前景。

参考文献

［1］Williams J G,Kubelik A R,Livak K J,et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucl Acids Res,1990,1 8:6531-6535.

［2］Welsh J,Petersen C,M McClelland.polymorphisms generated by arbitrar ily prim ed PCR in the mouse:application to strsin identification and genetic［J］.Nucl Acids Res,1991,19:303-306.

［3］Bardakci F,Skibinski D O F.Application of the RAPD technique in til apia fish:species and subspecies indentification.Heredity,1994,73:117-123.

［4］Lynch M.The similarity index and DNA fingerprinting.Mol Biol Evol,1990,7: 478-484.

［5］Perez-Enriquez R,Taniguchi N.Genetic structure of red sea bream(Pagrus major)population of Japan and the Southwest Pacific,using microsate llite DNA markers［J］.Fish Sci,1999,65(1):23-30.

［6］王伟继，孔杰，庄志猛等.真鲷野生群体和人工繁殖群体的同工酶遗传差异.生物多样性，2000，8(4)：391-396

［7］王志勇，王艺磊，林利民等.利用AFLP指纹技术研究中国沿海真鲷群体的遗传变异和趋势.水产学报，2001，25(4)：289-294.

［8］夏德全，曹萤，吴婷婷等.太湖中大银鱼、太湖新银鱼和寡齿新银鱼群体的遗传结构.水产学报，1999，23(3)：254-260.

［9］张四明，邓怀，汪登强等.长江水系鲢和草鱼遗传结构及变异性的RAPD研究.水生生物学报，2001，25(4)：324-330.

［10］张锡元，张德春，杨代淑等.长江鲢遗传多样性的随机扩增多态DNA分析，水产学报，1999，23(增刊)：7-14.

［11］张四明.分子生物学技术及其在渔业科学中的应用.水产学报，1997，21(增刊)：67 –76.

Genetic diversity of Pagrosomus major from three geographical

populations of Jiaozhou GuIf,Taiwan Strait and Beibu GuIf by RAPD

JIANG Shi-gui YANG Hui-rong

(South China Sea Fisheries Research Institute,CAFS,Guangzhou 510300,China)

Abstact :Random amplified polymorphic DNA(RAPD) technique wa s applied to assess the genetic variations among interpopulation of three wild s tocks(24 individuals) in Red Sea Bream, Pagrosomus major,from Jia ozhou GuIf(Qingdao),Taiwan Strait(Fujian) and Beibu Gulf(Hainan)Under predeter mined optimal reaction conditions,amplifications with 31 random primers selected from 60 gave 216 reproducible and stable fragments ganging from 200 to 2500bp There were 176 polymorphic fragmentsBased on RAPD data,the genetic distances o f interpopulation were 0.1645、0.1413、0.1073The maximum genetic distance o ccurred between Jianzhou Gulf and Beibu GuIf,the minimum did between Taiwan Stra it and Beibu GulfThat showed there were high genetic diversity among interpopu lation

Key words:Pagrosomus major ;Jiaozhou Gulf;Tai wan Strait;Beibu Gulf;Genetic diversity;RAPD

本页最后更新时间：2004年11月03日