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广西水产科技 2003年第1期（总第106期） 国外小瓜虫病的研究状况 余晓丽
甘
西
李咏梅 (广西水产研究所
530021) 徐德海 (美国农业部奥本水生动物疾病研究所) 提
要
小瓜虫是一种严重危害食用鱼和观赏鱼养殖的寄生虫，国外鱼病工作者非常重视小瓜虫病的研究。本文作者搜索了大量的文献，对国外小瓜虫病的药物治疗、感染机理、体外培养、免疫反应及疫苗试验等方面的研究动态作扼要介绍。 关键
小瓜虫
鱼病
治疗
感染
培养
免疫反应
疫苗 小瓜虫是一种危害性较大的纤毛虫，对宿主没有严格的选择性。绝大多数淡水鱼类都受其危害。该病流行面广，世界各地都有流行。由于小瓜虫病给食用鱼和观赏鱼的养殖造成严重损失，各国鱼病工作者都很重视小瓜虫病的研究。本文着重从药物治疗、感染机理、体外培养、免疫反应及疫苗试验等方面，介绍近年国外对小瓜虫病的研究进展，以供参考。 一、药物治疗 药物治疗的研究进展不大，这主要是西方国家从水产品食用安全方面考虑，严格控制在水产养殖中的使用药物，新药试验审批和注册程序也很复杂。目前药物研究主要从二方面进行，一是新药开发研究，寻找能控制小瓜虫的药物；二是在已注册、能在水产养殖使用的药物中，挖掘一些对治疗小瓜虫有效的药物。如硫酸铜和高锰酸钾在美国环境污染保护局中注册，用于杀灭水藻和处理水质，虽然没有在主管水产药品的美国食品药物管理部(FDA)属下的兽药中心(CVM)注册，但目前尚能在水产养殖中使用。Straus和Griffin〔1〕试验发现，高锰酸钾可杀灭小瓜虫幼虫，0.9mg/l高锰酸钾在4h内可杀灭95%的幼虫，半致死浓度为0.77mg/l，但对侵入皮肤的小瓜虫杀灭作用不大。在池塘中使用，高锰酸钾的有效浓度会受到水质的影响，特别是容易受到水中氧化物质的影响。硫酸铜在高于0.05mg/l浓度时，即可杀灭水中的小瓜虫幼虫。对已感染小瓜虫的鱼，用0.4mg/l的硫酸铜溶液在20℃左右连续处
理5d，有治疗效果。硫酸铜药效主要受水中悬浮颗粒的影响，悬浮颗粒浓度越高，硫酸铜药
效越差。当悬浮颗粒达到23mg/l时，硫酸铜几乎没有治疗作用〔2〕。在一些国家，孔雀石绿允许用于治疗观赏鱼的小瓜虫，但禁止在食用鱼中使用。孔雀石绿是一种致癌物质。它在酸性条件下以着色盐存在，在碱性条件下以甲醇基和还原性白色物质存在，另有二种微生物的分解产物。Ruider等人〔3〕用其衍生物及分解产物对寄生于鱼体表面的寄生虫进行治疗试验，发现只有着色盐和甲醇基两类孔雀石绿的衍生物能治疗小瓜虫。 Schmahl等人〔4〕发现，投喂含有奎宁药饵的饲料，能治疗感染了小瓜虫的观赏鱼。用电子显微镜观察，喂食药饵1d后，鱼体内的奎宁即对皮肤及鳃上小瓜虫胞膜及多种细胞器起到了一定的破坏使用。 在饲料中添加维生素C和E，能提高鱼体非免疫性防御机能，抵抗多种细菌病。Wahli等人〔5〕在投喂了添加维生素C和E的饲料后，用小瓜虫幼虫对鱼体进行了感染试验。他们发现，摄食了含维生素C和E的鱼存活率比较高，但是不能抵抗小瓜虫的感染。 二、感染机理 对鱼体具有感染力的是小瓜虫幼虫。幼虫呈卵圆形，全身覆盖纤毛，在水中游动，寻找入侵宿主的机会。小瓜虫幼虫在水中是如何寻找宿主、感染鱼的呢?鱼是否具有某些化学引诱物质，能吸引小瓜虫幼虫?Buchmann和Nielsen〔6〕为此进行了研究。他们在24孔的培养皿中，每孔加入500μL1.5%惰性琼脂，以孔的中线为界，在界线左右两边的琼脂各挖1
小洞，左边小洞加入测试物质，右边小洞加入水作对照。然后在界线中央放入小瓜虫幼虫悬
浮液，观察小瓜虫是否被左孔内测试物质吸引。测试物质分别为糖类、氨基酸、脂肪酸、谷胱甘肽、多肽、尿素和多种鱼的血清、粘液和血清分离物。结果表明，小瓜虫幼虫不受氨基酸、脂肪酸、糖、尿素、谷胱甘肽的引诱，而受各种鱼的血清及粘液吸引，甚至一些海洋鱼类的血清，也具有对淡水小瓜虫的引诱作用。血清分离后进行生化分析，发现小瓜虫幼虫能被188kDa以上的大分子吸引，这些大分子包括鱼的免疫球蛋白和一些大分子蛋白质。 Haas等人〔7〕对感染期的小瓜虫幼虫游动方式进行观察发现，当小瓜虫幼虫接近活鱼时，受到鱼体表分泌物的刺激，会“兴奋”起来，游动速度显著加快，鱼体表所含的氨基酸，刺激小瓜虫幼虫突然改变游动方向；当小瓜虫幼虫遇到含有鱼皮肤糖蛋白大分子的固体物时，幼虫会向固体物游去。这些游动方式，有助于小瓜虫幼虫增加与鱼的接触机会，提高感染率。 小瓜虫幼虫感染宿主后，一般会发育至成熟才离开。但在以下二种情况，会使小瓜虫提前结束其寄生生活、离开宿主。一是外界渗透压改变；二是宿主曾受过小瓜虫感染，产生了免疫力。这些提早离开宿主的小瓜虫是否还具有感染力?还能再感染鱼吗?一些实验室对此进行了研究。Wahli和Matthews〔5〕将感染小瓜虫的鲤鱼，放入一种细胞培养液—Eagle's Mininum Essential Medium(EMEM)，然后用水稀释1倍、2倍和不稀释，观察小瓜虫离开宿主情形。他们发现，不稀释的EMEM培养液，能刺激小瓜虫离开宿主；稀释1～2倍的培养液刺激作用则不明显，只有极少量的小瓜虫离开宿主。试验中，他们在鲤鱼感染小瓜虫后的1～24h、直至第6d的不同时间段里，用高浓度的EMEM培养液，刺激小瓜虫提前离开宿主，收集离体的小瓜虫，进行再感染试验。结果表明，24h之前离开宿主的小瓜虫，具有感染力；48h后收集到的离体小瓜虫，不能感染鱼。 鱼类受小瓜虫感染并康复后，就具有了免疫保护作用。小瓜虫碰上具有免疫力的个体时，也会侵入鱼体，但很快就会离开。24h后，多数小瓜虫即离开宿主。Wahli和Metthews〔5〕收集这些离体的小瓜虫，进行再感染试验，他们发现，在感染8h前离开免疫鱼的小瓜虫，多数能恢复其幼虫的梭型体形，并具有感染力，将他们加入水中，它们很快就能侵入鱼皮肤、鳍和鳃。但在感染8h后离开的小瓜虫，就失去了感染力，不能再感染鱼。 三、免疫反应 鱼受小瓜虫感染后产生的抵抗力，一般持续3个月至1年。抵抗力强弱与鱼获得免疫力的大小密切相关，而鱼免疫力大小又与鱼体状况、受小瓜虫感染程度和水环境有关。一般而言，体质较强的鱼，能承受小瓜虫的数量较多，存活下来产生的免疫力也较大。多次受到寄生虫感染所产生的免疫力比单次受感染所产生的免疫力要大。鱼受到小瓜虫感染时，会产生细胞反应和体液反应。细胞反应包括上皮细胞增生，上皮细胞增生可防止小瓜虫进一步入侵。新加坡的Sin等人〔8〕观察了小瓜虫感染金鱼的细胞免疫反应。他们2次对金鱼进行腹腔注射小瓜虫活幼虫，每尾鱼剂量为2.3×10.6个幼虫，注射间隔时间为30d，对照鱼注射生理盐水。第2次注射的2周后，皮下注射2.5×10.5个小瓜虫幼虫进行皮试，结果发现，注射后8h，皮肤在抗原注射部位逐渐增厚，皮肤组织切片后染色检查，发现大量单核白细胞渗透于抗原注射部位，而注射生理盐水的对照组，却未见白细胞渗透。Sin等人在观察细胞反应的同时，用失动检测方法对鱼的血清及粘液抗体效价进行测定，注射了小瓜虫疫苗的处理组，血清及粘液抗体效价比没注射疫苗的对照组要高得多，他们认为鱼体液反应和细胞反应共同参与消灭入侵上皮组织的小瓜虫。 小瓜虫纤毛膜和细胞膜含有一些蛋白质，这些蛋白质占据纤毛膜的60%。主要是分子量为46-60kDa的多酞。不同小瓜虫分离株的蛋白质分子量可能不完全一样。当特异性抗体与这些蛋白质结合时，会使小瓜虫失去游动能力，聚集成团。故小瓜虫纤毛膜和细胞膜所含的这些40～60的多酞抗原，被称为失动抗原。Clark等人〔9〕收集提纯小瓜虫的失动抗原，腹腔注射到小白鼠，再用小白鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞进行培养，收集含有单克隆抗体的细胞培养液，他们用这种单克隆抗体对小瓜虫进行处理，发现能使小瓜虫幼虫
失去游动能力。他们将这种特异性单克隆抗体注射到已感染小瓜虫3d的斑点叉尾鮰，第2d检查，发现用抗体处理的感染鱼，小瓜虫已消失。受抗体
影响而离开宿主的小瓜虫，经4%福尔马林固定后，用荧光素标记，发现小瓜虫体表附着单克隆抗体。而没注射特异性抗原的对照感染鱼，因没受到被动免疫保护，小瓜虫感染严重，大部分感染鱼死亡。根据这些结果，Dickerson和Clark〔10〕推断，小瓜虫纤毛膜及细
胞膜含有的失动抗原，能刺激鱼产生免疫反应，抵抗小瓜虫。 最近，徐德海等人〔11〕将具有小瓜虫免疫力的斑点叉尾鮰皮肤进行表面消毒后，剪剥下来，切成5mm×5mm的小块，然后加入培养液中培养12h至168h，在此过程中，每隔24h全部收集1次培养液，再加入新的培养液进行培养。对收集到的培养液进行抗体效价检测，发现免疫鱼的皮肤培养液含有抗体，效价以24h的培养液最高。用ELISA和Western
bolt的方法也证明培养液内含有抗体。这些培养液稀释16～64倍后，仍能使小瓜虫幼虫失去游动能力，凝集成团。而对照鱼(非免疫力鱼)的皮肤培养液对小瓜虫没有凝集作用。因为他们采用的是皮肤离体培养，在培养液中的抗体只能由皮肤的淋巴细胞产生，排除了由皮肤外产生抗体，再输送到皮肤的可能性。 四、小瓜虫疫苗 小瓜虫疫苗的研究仅处于实验室阶段，可分活虫疫苗、灭活疫苗、遗传工程合成疫苗3种。用小瓜虫活体感染时，控制感染虫的数量，使鱼只受轻微感染，然后用药物治疗，当鱼康复后，即具有对小瓜虫的免疫力。活疫苗能刺激鱼产生较强的免疫力，其免疫保护作用也能持续较长时间。但用活体小瓜虫做疫苗，控制不当会导致人为的感染。目前尚未有减毒的小瓜虫疫苗。一般是用杀灭的小瓜虫，加入佐剂或不加佐剂制成灭活疫苗，采用腹腔注射，在一定程度上能抵抗小瓜虫的感染，但效果远比活疫苗要差。 He等人〔12〕用遗传工程方法，根据小瓜虫失动抗原的氨基酸的分子顺序，合成6种低聚核苷酸，组装成一个316bp基因片段，内含完整的小瓜虫48kDa失动抗原的抗原决定簇，克隆到一细胞表达媒介PGEX2T。基因片段被导入大肠杆菌，成功获得了谷胱甘肽S-转移酶与失动抗原结合的蛋白质(GST-iAgI蛋白质)。从大肠杆菌溶解产物中提纯GST-iAgI蛋白质，加入佛氏完全佐剂制成疫苗，对金鱼进行腹腔注射，每尾剂量为15μg，两周后再用不加佐剂的疫苗以相同剂量注射。一周后，用小瓜虫进行攻毒试验。结果表明，使用疫苗的鱼，成活率高达95%，而对照鱼成活率只有55%。 美国Cornell大学和佐治亚大学正在研究小瓜虫DNA疫苗，他们用遗传工程的方法，重组小瓜虫的失动抗原，然后将其插入到Tetrahymena(一种能人工培养的纤毛虫)，如果小瓜虫的失动抗原在Tetrahymena纤毛虫上表达成功，他们就可大量培养Tetrahymena，就可获得大量的小瓜虫抗原，进一步就可生产小瓜虫疫苗。 五、体外培养 小瓜虫的寄生阶段，从小瓜虫幼虫感染开始，到发育为成熟成虫、离开鱼体为止，需要在宿主鱼上完成。由于小瓜虫这一寄生特性，目前尚未有可行的、能大量培养小瓜虫的方法。国外有几个研究室在攻克这一难题，希望找到一种体外培养方法，能替代活鱼，满足小瓜虫寄生阶段的需求。徐德海等人〔13〕进行了小瓜虫在斑点叉尾鮰离体组织培养的早期发育观察试验，他们采集叉尾鮰的皮肤、鳃和鳍条，加入培养液Medium199进行培养，培养液添加25%小牛血清，50IU/ml青霉素和50IU/ml链霉素，将小瓜虫加入培养的组织，1h后，88%的幼虫入侵到组织，找到合适的位置寄生，卵型的体形逐渐变为圆球形，开始有规则的转动。随后2d，虫体转动速度较均匀，约每分钟9～11转。感染后8h，存活良好，存活率大于97%；24h后，小瓜虫体积约增大1倍，存活率为68%。在25℃培养条件下，48h后，部分小瓜虫转动速度明显变慢，一些垂死的小瓜虫，转动速度更慢，虫体虚弱，细胞质内颗粒减少，一些小瓜虫胞膜破裂。存活率只有8.4%。 徐德海等人〔13〕还用小瓜虫幼虫加入太阳鱼鳍单层细胞，对小瓜虫附着和生长情况进行观察，24h后，幼虫还在培养液中游动，没有附着，体形不变，表明该培养条件没能满足小瓜虫早期发育的需要，可能需要添加鱼血清或粘液。Nielsen和Buchmann〔14〕将小瓜虫幼虫加到鲤鱼上皮细胞培养液中，培养液为Eagle's
Minimal Essential
Medium，外加5%小牛血清，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素，3%鳟血清，1%鳟粘液，在15℃培养时，卵圆形
的幼虫2d后发育成球形成虫，存活时间长达12d，体积增大，但没能长至成熟成虫。 目前用以治疗小瓜虫的药物多数只能杀灭小瓜虫幼虫，对寄生鱼体的成虫，由于有表皮囊泡包裹着，加上有粘液覆盖，有效药物浓度很难到达寄生的成虫，一般不易杀灭成虫。通过疫苗的使用，用免疫的方法预防小瓜虫病，将是较为理想的方法。要使小瓜虫疫苗能在生产上使用，关键的一步，就要解决如何大量获得小瓜虫的抗原。目前，细菌和病毒培养，都不成问题，通过用适宜的培养基或细胞培养，控制培养条件，就可大量生产细菌或病毒抗原。但小瓜虫抗原问题，尚处在攻关阶段，目前的研究主要集中在以下几方面：(1)寻找适宜的培养基和培养方法，希望这些培养基能代替活鱼为小瓜虫生长成熟提供营养，附着及其它必需的条件，使小瓜虫幼虫能在鱼体外完成生活周期；(2)用细胞培养方法替代活鱼，使用小瓜虫能在培养的细胞中生长成熟；(3)用遗传工程方法，将小瓜虫中特异性抗原分离出来，整合到能人工培养的纤毛虫或细菌中，进行人工培养，从而获得大量的小瓜虫抗原。 参考文献 〔1〕Straus DL,and Griffin BR.2001.Prevention of an initial
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