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广西水产科技 2003年第1期（总第106期）
美国红鱼虹彩病毒ATP酶基因ORF核心序列克隆与分析 严家彬1，2，李新辉**1，李凯彬1，吴淑勤1 (1 中国水产科学研究院珠江水产研究所
广州
510380； 2 湛江海洋大学水产学院
湛江
524025) 基金项目：广东省自然科学基金项目“鳜鱼病毒基因表达及功能分析”资助(200106 75) 作者简介：严家彬(1977-)，男，研究生；**通讯作者：李新辉；E-mail:lxhui01@163net 提 要
根据真鲷虹彩病毒ATP酶基因设计引物，从患暴发性流行病的美国红鱼(Sciaenop ocellatus)脾脏组织中扩增到一条约560bp的特征带。将PCR产物克隆入pGEMR-TEasy载体，序列分析表明，PCR产物长563bp，与报道的从真鲷虹彩病毒ATPase基因ORF中扩增出的片段长度一致。PCR产物序列与几种脊椎动物虹彩病毒ATPase基因的ORF序列比较发现，克隆序列与所报道的鱼类虹彩病毒ATPase基因OPF的核心序列的同源性达95.6%以上；与蛙病毒3(FV3)的ATPase基因同源性为40%左右。据此认为引起美国红鱼暴发性流行病的病原为虹彩病毒，暂定名为美国红鱼虹彩病毒(Sciaenop
Ocellatus Irid ovirus，简称SOI)。序列比较和系统树分析表明，我们比较的几种引起鱼类系统性疾病的虹彩病毒很可能是同一类群的病毒，但他们既不属于蛙病毒属，也不属于淋巴囊肿病毒属，可能是虹彩病毒科的一个新类群。 关键词
美国红鱼
虹彩病毒
ATP酶基因ORF
序列分析
系统进化 Cloning
and Sequence Analysis for ATPase Gene Core Sequence of Sciaenop
Ocellatus Iridovirus YAN
Jia-bin1，2，LI
Xin-hui**1，LI Kai-bin,WU Shu-qin1 (Pearl
River Fishery Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Guan
gzhou, 510380,Zhanjiang
Ocean University,Zhanjiang,524025) Abstract : By using a pair of primers based on the ATPase gene
of RSIV,a special nucleic acid band with about 560bp in length has
been amplifi ed from the spleen of Sciaenop Ocellatus infected with
some acut e epizootic diseaseThe PCR product was cloned into vector pGEMR-T Easy,a nd the result
of sequence analysis showed that it was precisely 563bp in length which w
as consistent with the amplified product from RSIV by using the same
primersCo mparing the PCR product with the opening reading
frames(ORFS) of ATPase genes of several
vertebrate iridoviruses,we found that the sequence homology between the
piscine iridoviruses and the Frog Virus 3 was over 40%,and the
sequence homolog ies were over 956% among the piscine iridovirusesSo we conclude that iridov irus was the main pathgeon
caused the acute disease of Sciaenop Ocellatus,and we temporarily
name it Sciaenop Ocellatus Iridovirus (SOI)Our
sequence analyses also
showed that the several piscine iridoviruses which resulted in sy stemic
diseases in fish might belong to the same genus,but they surely are inclu
ded neither in the genus Ranavirus nor in the genus LymphocystivirusIn fact,we presume
that they might belong to a new genus of Iridoviridae Key
words: Sciaenop
ocellatus,iridovirus,ATPase gene ORF,sequence analysis,phylogeny 美国红鱼(Sciaenop ocellatus)，又叫眼斑拟石首鱼，原产美国，是一种商品经济价值较高的鱼类。由于耐低氧、具有广温广盐性，且病害少，近年来在福建和广东沿海多有养殖。但在1999年8～10月，广东沿海网箱养殖的美国红鱼流行一种暴发性传染病。李凯彬等人根据日本报道的真鲷虹彩病毒ATP酶基因ORF设计引物，从患暴发性流行病的美国红鱼脾脏组织中扩增到一条约560bp的特征带，与报道的从真鲷虹彩病毒ATP酶基因ORF中扩增出的片段大小一致，认为该病的致病原可能是虹彩病毒［1］。本文将PCR产物克隆入pGEM R-TEasy载体，进行序列分析，并与资料报道的虹彩病毒ATP酶基因ORF进行比较。现将我们的研究报告如下： 1
材料与方法 1.1
材料 濒死病鱼取自广东省阳江闸坡鱼排，长约10cm，体重约20g，表现典型的暴发性症状。常规镜检未发现寄生虫，多种培养基进行细菌分离未见有菌落生长。电镜检测在病鱼脾脏细胞中发现许多截面为六边形的病毒颗粒。 1.2 PCR扩增 引物设计参照Kurita等［2］的方法。合成引物：P1：5-CAAACCACAGC GCGGCAAGT和P2：5-AGTAGCGCACCATGTCCTCC。扩增模板的制备参照文献［1］。反应体积为20ul，引物O.4umol/L。Mg2+2.5mmol/L，dNTP0.4mmol/L，TaqDNA聚合酶1U。反应条件为：94℃预处理5min，进行30个循环，每个循环反应包括94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环完成后，72℃延伸7min。取反应液5ul在1.0%琼脂糖凝胶上电泳观察。 1.3 PCR产物的克隆 PCR产物用Nucleo TraPRDNA纯化试剂盒回收纯化后插入pGEMR-T Easy载体，转入E.coliDH5
a中，用蓝白斑法筛选重组子，碱法提质粒，经EcoRI酶切鉴定重组子。 1.4
序列分析 重组质粒经DNA GEL
EXTRACTION KIT(SILVER BEADS)抽提纯化后，用ABI
PRIS MTM测序。所得序列经Internet进入GenBank进行BLAST比较。此外，利用软件Vector
TNI对Ge nBank中搜索到几种脊椎动物虹彩病毒ATPase基因进行同源性比较，同时对其编码的推测的蛋白性质加以比较。 2 结果 2.1 PCR扩增 取具典型暴发性症状的美国红鱼脾脏组织进行匀浆，由匀浆液提取的核酸作模板。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出与预计大小(563bp)相符的单一核苷酸片段(图1)。 2.2重组子的构建与鉴定 PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳后，切下电泳条带，按Nucleo
TraPRDNA纯化试剂盒说明书回收纯化后插入到pGEMR-T
Easy载体中，重组质粒经EcoRI酶切得相应大小的片段，表明PCR产物已克隆入载体中(图1)。 2.3PCR产物测序与序列分析 2.3.1 ATPase基因核心区序列比较 重组质粒测序得563bp扩增片段序列(图2)。序列经Internet进入GenBank进行BLAST比较，结果见表1。可见扩增序列与已知的几种鱼虹彩病毒ATPase基因ORF的核心区相应序列间有极高的同源性。 其中ISKNV为Infectious spleen and kidney necrosis virus(GenBank登录号为AF371960)，SCV为siniperca
chuatsi virus(AF345198),RSIV为Red sea
bream iridovirus(AB007367),SBIV为Sea bass
iridovirus(AB043977),ALIV为African
lampeye iridovirus(AB043979),GIV为Grouper
iridovirus(AB043978),TGIV为Taiwan
Grouper iridovirus(AF462343),GSIV为Giantseaperch
iridovirus(AF462344),LMBV为Largemouth
bass iridovirus(AF462345) 图1：PCR产物及重组子的酶切图 Fig1:PCR
products and restriction ma pping analysis
of the recombinant 1，2：PCR
products 3：λDNA/Hind Ⅲ 4：recombinant/EcoR Ⅰ 1 CAAACCACAGCGCGGCAAGTCGGTGCTAATCAAATCTATCATTGCGGCCAAGCGGCACATAATTCCCGCGGCCGTCGTGA 81 TATCGGGCTCCGAGGAGGCCAACCACTTCTACAGCAAGCTGTTGCCTAACTGCTTTGTGTACAACAAGTTTGACGCCGAC 161 ATTATCACACGTGTCAAGCAGCGACAGCTGGCATTAAAGAACGTGGACCCCGAGCACTCGTGGCTCATGTT
GATCTTTGA 241 CGACTGCATGGATAACGCCAAGATGTTTAATCACGAGGCCGTCATGGACCCGTTCAAGAACGGGCGTCATT
GGAATGTTT 321 TGGTCATAATAGCCTCACAGTACATCATGGACTTGAACGCCAGCCTGAGGTGTTGTATAGACGGTGTCTTT
TTATTTACA 401 GAAACAAGCCAGACATGTGTGGACAAGATTTACAAACAGTTTGGGGGCAACATACCCAAGCAGACATTTCA
CACATTGAT 481 GGAGAAGGTTACACAGGATCACACATGCTTATACATTGACAACACAACCACCAGGCAGAAATGGGAGGACA
TGGTGCGCT 561 ACT 图2 美国红鱼病毒ATPase基因核心区序列(563bp) Fig2 ATPase gene core sequence of Sciaenop ocellatus virus 表1
PCR产物与几种鱼虹彩病毒ATPase基因核心序列同源性比较 Table1 Homology comparasion
between PCR product and ATPase gene core seque nces of several
Pisicine
iridoviruses
项目
ISKNV SCV
RSIV SBIV
ALIV GIV
TGIV GSIV
LMBV 美国红鱼(SOI) 99%
95% 95%
95% 95%
95% 99%
95% 95%
2.3.2 ATPase基因开放读码框(ORFS)比较 与鱼虹彩病毒相关的几种ATPase基因开放读码框的比较见图3。表2是序列比较的结果。可见ALIV与LMBV仅在275位有一个碱基的差别；而LMBV、GIV和GSIV的开放读码框完全相同；另外ISKNV与TGIV的开放读码框也完全相同(相同的只列出一个)。 ALIV 1 atggaaatcc aagagttgtc cctgacggag ctgcggcctg
tgaaaccgga cgacgaaatg ggtggaatga LMBV ISKNV
a t
a
g
RSIV
c
c
g
a
GSIV
c
c
g
a
ALIV 71 agctcattgt gcttggcaaa ccacagcgcg gcaagtcggt gctaatcaaa
tctatcattg cagccaagcg LMBV ISKNV
g
RSIV
a GSIV
a
ALIV 141 gcacataatt cccgccgcgg tagtgatatc gggctccgag gaggccaacc acttctacag
caagctattg LMBV ISKNV
c g
c c g
g RSIV t
c g
a a
a GSIV
c c
g a g
a ALIV 211 cctaactgtt ttgtgtacaa caagtttgac gctgacatta tcacacgcgt caagcagcgg
cagcgggcac LMBV
t ISKNV
c
c
t a
t t RSIV
t
t
c a
t c GSIV
t
t
c g
t c ALIV 281 taaagaatgt ggaccctgag cactcgtggc tcatgttgat ctttgacgac tgcatggata
acgccaagat LMBV ISKNV
c
c RSIV
t
t GSIV
t t ALIV 351 gtttaatcac gaggccgtca tggacctgtt caagaacggg cgtcactgga atgttctggt
cataatagct LMBV ISKNV
c
t t
c RSIV
t
c c
t GSIV
c
c c
t ALIV 421 tcacagtaca tcatggattt gaatgccagc ctgaggtgtt gtatagatgg tatcttttta
tttacagaaa LMBV ISKNV
c c
c
c g
RSIV
a t
t
c a
GSIV
c t
t
t a
ALIV 491 caagccagac atgtgtggac aagatttaca aacagtttgg gggcaacata ccaaagcaga
catttcacac LMBV ISKNV
c
RSIV
a
GSIV
a
ALIV 561 gttgatggaa aaggttacac aggatcacac atgcttatat attgacaaca caaccaccag
gcagaaatgg LMBV ISKNV a
g
c
a RSIV g
a
t
g GSIV g
a
t
a ALIV 631 gaggacatgg tgcgctacta caaggcgccg ctgttgacag acgccgatgt gggctttggc
tttaaggatt LMBV ISKNV a RSIV g GSIV g
ALIV 701 acaaggctgg cgtggtgtaa LMBV ISKNV
c RSIV
t GSIV
t 图3
几种鱼虹彩病毒ATPase基因开放读码框序列同源性比较 Fig3 Sequence homology comparasion for the ORFS of ATPase gene of several
pisicine iridoviruses 表2
几种鱼虹彩病毒ATPase基因开放读码框的序列同源性 Table2 The results of sequence homology comparasion项目
ALIV
ISKNV
RSIV GSIV
TGIV
GIV SBIV LMBV
99.9%
96.0% 99.0%
100% 96.0% 100%
99.0% ALIV
95.8%
98.9%
99.9% 95.8%
99.9% 98.9% ISKNY
95.6%
96.0%
100% 96.0%
95.6% RSIV
99.0%
95.6%
99.0%
100% GSIV
96.0%
100% 99.0% TGIV
96.0% 95.6% GIV 99.0% 2.3.3 几种鱼虹彩病毒ATPase基因与其他生物ATPase基因的比较 将几种鱼虹彩病毒ATPase基因同蛙病毒3(FV3)、衣藻的叶绿体、肺炎链球菌1244株及白色假丝酵母的ATPase基因比较，发现同源性较低，最高为ISKNV与FV3，同源性达46.3%，最低为白色假丝酵母与SBIV，同源性仅为13.9%。具体结果见表3。 表3 几种鱼虹彩病毒ATPase基因与一些低等生物ATPase基因的比较 Table3 ATPase gene comparation among pisicine iridoviruses and some lower life-forms项目
蛙病毒3
衣藻的叶绿体
肺炎链球菌1244株
白色假丝酵母 ALIV
45.3%
33.5%
43.0%
14.7% ISKNV
46.3%
33.2%
43.6%
14.7% SBIV 45.1% 34.7% 43.7% 13.9% 蛙病毒3、衣藻的叶绿体(a亚单位)、肺炎链球菌1244株(A亚单位)及白色假丝酵母(PMA1)的ATPase基因的GenBank登录号分别为M80551、X60298、AF171002和M74075。 2.3.4 系统发育进化分析 用Vector NTI Suite 6软件分析几种ATPase基因编码的蛋白，其特性比较如表4所示。可见所报导的几种鱼虹彩病毒的ATPase基因编码的蛋白非常相似，均由239个氨基酸组成，相对分子量也均在27400左右。其中GSIV、GIV、SBIV、RSIV和LMBV连等电点都相同，为7.18。ISKNV和TGIV的蛋白性质也完全相同，但等电点为7.75。其中Strep、Chlam、PAM1分别代表肺炎链球菌1244株、衣藻的叶绿体和白色假丝酵母。 根据几种ATPase基因的核酸序列和编码的氨基酸序列绘制的系统发育进化树见图4。可以看出所报道的鱼虹彩病毒的亲缘关系很近，与FV3的关系相对较远。 表4
几种ATPase基因编码的蛋白性质比较 Table4 The comparative analysis for the putative proteins of several ATPas e genes项目
长度(aa)
相对分子质量
pI GSIV
239
27388
7.18 GIV
239
27388
7.18 SBIV
239
27388
7.18 RSIV &n |